TLR9/MyD88/JNK信号通路在百草枯中毒急性肺损伤中的作用机制研究
发布时间：2025-07-18 21:40
目的:百草枯中毒是临床中最为危险的中毒性疾病之一,致死率可达30-70%,临床经过痛苦且无特效解毒剂。急性肺损伤是中重度百草枯中毒早期的主要表现,其进展快,并发症多,可迅速进展为呼吸衰竭及多器官功能障碍而导致死亡。作为除草剂,具有联吡啶结构的百草枯会阻断细胞内电子传递链,原位产生大量活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）造成强烈的脂质过氧化,直接破坏细胞膜的完整性从而起到植物杀伤的作用。百草枯中毒时进入人体后在多胺转运系统作用下浓聚于肺脏,引起急性肺损伤,但对于其具体机制目前还不完全清楚。Toll样受体（Toll-like receptors,TLR）作为固有免疫系统组成部分,本是发挥着识别病原并激活免疫系统发动免疫杀伤的重要作用,但近年的研究发现其在急性肺损伤的进程中却起到了推动作用研究显示。在急性肺损伤过程中,病原体相关分子模式（Pathogen-associated Molecular Patterns,PAMPs）,如革兰阴性菌膜上的脂多糖（LPS）、细菌和病毒共有的非甲基化DNA（CpG DNA）或内源性非甲基化DNA如线粒体DNA（mitochond...
【文章页数】：99 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略语
第一部分 ：MyD88基因敲除可减轻百草枯中毒引起的急性肺损伤
1 前言
2 材料与方法
2.1 材料
2.2 动物
2.3 模型构建及动物分组
2.4 标本的采集及保存
2.5 血清TNF-α,IL-1β含量测定
2.6 肺脏湿/干重比值测定
2.7 肺组织损伤评分方法
2.8 RealtimeRT-PCR检测肺组织MyD88,TNF-α及IL-1βmRNA的表达
2.9 免疫荧光法检测MyD88及p-p65表达
2.10 Westernblot法检测肺组织TLR4、TLR9、MyD88、p-p65的表达
2.11 统计学分析
3 结果
3.1 小鼠肺湿/干重比值及肺组织损伤评分
3.2 血清TNF-α和IL-1β水平
3.3 RealtimeRTPCR检测细肺组织
3.4 MyD88及p-p65在肺组织中的表达分布
3.5 Westernblot法检测小鼠肺组织
4 讨论
5 结论
第二部分 ：TLR9介导了百草枯中毒导致的急性肺损伤
1 前言
2 材料与方法
2.1 材料及仪器
2.2 动物
2.3 模型构建及动物分组
2.4 标本的采集及保存
2.5 血清炎性因子TNF-α和IL-1β含量测定
2.6 肺组织损伤评分
2.7 免疫荧光法检测TLR9及p-p65表达
2.8 Westernblot法检测肺组织TLR9、MyD88、p-IRAK4、p-p65的表达
2.9 细胞培养
2.10 模型构建及细胞分组
2.11 AnnexinV-PI双染法检测细胞凋亡
2.12 RealtimeRT-PCR检测TLR9、TNF-α、IL-1βmRNA
2.13 ELISA检测TNF-α、IL-1β水平
2.14 免疫荧光法检测TLR9,p-p65表达
3 结果
3.1 小鼠肺组织损伤评分
3.2 血清TNF-α和IL-1β含量
3.3 TLR9及p-p65在肺组织中的表达分布
3.4 Westernblot法检测不同时间点小鼠肺组织
3.5 细胞活性检测及实验处理浓度的选择
3.6 细胞凋亡的检测
3.7 RealtimeRT-PCR检测细胞裂解液
3.8 上清液TNF-α和IL-1β含量测定
3.9 TLR9及p-p65在A549细胞中的表达
4 讨论
5 结论
第三部分 ：TLR9经JNK介导了百草枯中毒所引起的急性肺损伤
1 前言
2 材料及方法
2.1 实验材料
2.2 动物及模型构建
2.3 大鼠标本采集及肺湿重/干重比测定
2.4 大鼠肺组织HE染色及肺损伤评分
2.5 DHE荧光染色法检测大鼠肺组织ROS生成
2.6 细胞培养及模型构建
2.7 AnnexinV-PI双染法检测细胞凋亡
2.8 ELISA法检测TNF-α及IL-6水平
2.9 RT-qPCR法检测TNF-α及IL-6的mRNA水平
2.10 Westernblotting检测蛋白表达
2.11 EMSA法检测AP-1与NF-κBp-p65的转录因子DNA结合活性
2.12 TLR9特异性拮抗剂ODN2088干预小鼠后进行百草枯攻毒之后HE评估急性肺损伤程度；Westernblotting检测肺组织JNK磷酸化水平
2.13 统计学分析
3 结果
3.1 SP干预降低了百草枯中毒大鼠的肺湿重/干重比(W/D)及肺损伤
3.2 SP干预减弱了百草枯中毒大鼠肺组织中ROS及炎症因子mRNA水平
3.3 SP干预降低了百草枯中毒大鼠肺组织中JNK磷酸化水平及AP-1DNA结合活性,但未影响NF-κBp-p65DNA结合活性
3.4 PQ对A549细胞存活率的影响具有浓度依赖性
3.5 SP干预减少了百草枯染毒细胞的凋亡率
3.6 SP干预减弱了百草枯染毒的A549细胞中ROS及炎症因子mRNA水平
3.7 SP干预减少了百草枯染毒细胞的p-JNK蛋白、cleavedcaspase-3蛋白水平,并减弱了AP-1及NF-κBp-p65的DNA结合活性
3.8 SP干预减弱了百草枯染毒细胞上清液及染毒大鼠肺泡灌洗液的炎症因子水平
3.9 TLR9抑制剂ODN2088可减少百草枯中毒时JNK的磷酸化激活从而减轻急性肺损伤程度
4 讨论
5 结论
本研究创新性的自我评价
参考文献
综述
参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简介
本文编号：4057464
【文章页数】：99 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略语
第一部分 ：MyD88基因敲除可减轻百草枯中毒引起的急性肺损伤
1 前言
2 材料与方法
2.1 材料
2.2 动物
2.3 模型构建及动物分组
2.4 标本的采集及保存
2.5 血清TNF-α,IL-1β含量测定
2.6 肺脏湿/干重比值测定
2.7 肺组织损伤评分方法
2.8 RealtimeRT-PCR检测肺组织MyD88,TNF-α及IL-1βmRNA的表达
2.9 免疫荧光法检测MyD88及p-p65表达
2.10 Westernblot法检测肺组织TLR4、TLR9、MyD88、p-p65的表达
2.11 统计学分析
3 结果
3.1 小鼠肺湿/干重比值及肺组织损伤评分
3.2 血清TNF-α和IL-1β水平
3.3 RealtimeRTPCR检测细肺组织
3.4 MyD88及p-p65在肺组织中的表达分布
3.5 Westernblot法检测小鼠肺组织
4 讨论
5 结论
第二部分 ：TLR9介导了百草枯中毒导致的急性肺损伤
1 前言
2 材料与方法
2.1 材料及仪器
2.2 动物
2.3 模型构建及动物分组
2.4 标本的采集及保存
2.5 血清炎性因子TNF-α和IL-1β含量测定
2.6 肺组织损伤评分
2.7 免疫荧光法检测TLR9及p-p65表达
2.8 Westernblot法检测肺组织TLR9、MyD88、p-IRAK4、p-p65的表达
2.9 细胞培养
2.10 模型构建及细胞分组
2.11 AnnexinV-PI双染法检测细胞凋亡
2.12 RealtimeRT-PCR检测TLR9、TNF-α、IL-1βmRNA
2.13 ELISA检测TNF-α、IL-1β水平
2.14 免疫荧光法检测TLR9,p-p65表达
3 结果
3.1 小鼠肺组织损伤评分
3.2 血清TNF-α和IL-1β含量
3.3 TLR9及p-p65在肺组织中的表达分布
3.4 Westernblot法检测不同时间点小鼠肺组织
3.5 细胞活性检测及实验处理浓度的选择
3.6 细胞凋亡的检测
3.7 RealtimeRT-PCR检测细胞裂解液
3.8 上清液TNF-α和IL-1β含量测定
3.9 TLR9及p-p65在A549细胞中的表达
4 讨论
5 结论
第三部分 ：TLR9经JNK介导了百草枯中毒所引起的急性肺损伤
1 前言
2 材料及方法
2.1 实验材料
2.2 动物及模型构建
2.3 大鼠标本采集及肺湿重/干重比测定
2.4 大鼠肺组织HE染色及肺损伤评分
2.5 DHE荧光染色法检测大鼠肺组织ROS生成
2.6 细胞培养及模型构建
2.7 AnnexinV-PI双染法检测细胞凋亡
2.8 ELISA法检测TNF-α及IL-6水平
2.9 RT-qPCR法检测TNF-α及IL-6的mRNA水平
2.10 Westernblotting检测蛋白表达
2.11 EMSA法检测AP-1与NF-κBp-p65的转录因子DNA结合活性
2.12 TLR9特异性拮抗剂ODN2088干预小鼠后进行百草枯攻毒之后HE评估急性肺损伤程度；Westernblotting检测肺组织JNK磷酸化水平
2.13 统计学分析
3 结果
3.1 SP干预降低了百草枯中毒大鼠的肺湿重/干重比(W/D)及肺损伤
3.2 SP干预减弱了百草枯中毒大鼠肺组织中ROS及炎症因子mRNA水平
3.3 SP干预降低了百草枯中毒大鼠肺组织中JNK磷酸化水平及AP-1DNA结合活性,但未影响NF-κBp-p65DNA结合活性
3.4 PQ对A549细胞存活率的影响具有浓度依赖性
3.5 SP干预减少了百草枯染毒细胞的凋亡率
3.6 SP干预减弱了百草枯染毒的A549细胞中ROS及炎症因子mRNA水平
3.7 SP干预减少了百草枯染毒细胞的p-JNK蛋白、cleavedcaspase-3蛋白水平,并减弱了AP-1及NF-κBp-p65的DNA结合活性
3.8 SP干预减弱了百草枯染毒细胞上清液及染毒大鼠肺泡灌洗液的炎症因子水平
3.9 TLR9抑制剂ODN2088可减少百草枯中毒时JNK的磷酸化激活从而减轻急性肺损伤程度
4 讨论
5 结论
本研究创新性的自我评价
参考文献
综述
参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
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本文编号：4057464
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