内切菊粉酶的基因挖掘、异源表达和半理性改造

发布时间：2025-05-28 00:24

　　随着人们健康意识的提高,低聚果糖受到广泛的关注。它是一种强效益生元,具有促进肠道菌群平衡,提高人体免疫力等多种生理功效,在食品领域中有重要的工业价值。内切菊粉酶可以水解菊粉内部的β-2,1糖苷键获得低聚果糖。与传统的利用果糖基转移酶的生产方法相比,该法操作简单、副产物含量低、生产效率高。但目前内切菊粉酶的来源十分有限,且存在产量低、酶学性质不佳等问题,难以满足工业生产的需要。因此寻找多样的微生物来源,从中获得能够高效、专一催化菊粉产生低聚果糖的新型内切菊粉酶十分必要。本研究通过理性基因挖掘发现首个酵母来源的内切菊粉酶基因,成功将其在大肠杆菌（Escherichia coli）中实现可溶性表达;将该酶分离纯化后,探究其酶学性质和水解产物;同时,通过发酵优化提高其产量,通过分子对接建模和定点突变提高其催化活力。论文主要研究成果如下:1.内切菊粉酶的基因挖掘和异源表达。通过理性基因挖掘获得三段不同微生物来源的潜在内切菊粉酶,通过酶活验证得到Lipomyces starkeyi NRRL Y-11557唯一可能具有内切菊粉酶活性,但产酶水平不高。对该酵母来源的潜在内切菊粉酶基因序列inu3进行深...

【文章页数】：51 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图1-2内切和外切菊粉酶的作用位点及产物

菊粉酶(inulinase)是一类作用于β-2,1糖苷键的水解酶,属于糖苷水解酶(glycosidehydrolases,GH)第32家族。菊粉酶分为外切菊粉酶(exo-inulinase,EC3.2.1.80)和内切菊粉酶(endo-inulinase,EC3.2.1.7....

图1-3来自A.ficuum的内切菊粉酶INU2的晶体结构及其活性位点[48]

2012年,内切菊粉酶晶体结构首次成功解析[48],该蛋白来自A.ficuum,截至目前为止仍是唯一被解析的内切菊粉酶晶体。内切菊粉酶的三维结构具有GH32家族的共同特点,如图1-3所示:N端由5个叶片形成的封闭催化活性口袋,每个叶片包含4个反向平行的β-折叠片,形成经典的“W”....

图3-1潜在内切菊粉酶的保守氨基酸序列比对

来源于A.ficuum[48](NCBI登录号:O94220.1)、P.purpurogenum[60](NCBI登录号:BAA12321.1)和Arthrobactersp.S37[61](NCBI登录号:CAB63119.1)的内切菊粉酶极具代表性,它们经过实验验证并被很多....

图3-2潜在内切菊粉酶的系统发育分析

对这三株潜在内切菊粉酶构建系统进化树[55],如图3-2所示。inu1与外切菊粉酶具有更近的进化距离,inu2和inu3与内切菊粉酶具有更近的进化距离。其中,inu2来自T.devorans与细菌具有更近的进化距离,inu3来自L.starkeyiNRRLY-11557与霉菌....

本文编号：4047783