向日葵锈菌金属蛋白酶基因的生物信息学分析及其原核表达

发布时间：2025-07-07 04:23

　　向日葵锈病(Puccinia helianthi Schw.)是向日葵重要病害之一,严重危害向日葵的品质及含油量。向日葵锈菌分泌的胞外蛋白酶是其致病因子之一,这种蛋白酶破坏植物细胞外部保护屏障,有利于病菌侵入,导致寄主感病。本研究基于前期实验室对向日葵锈菌转录组数据分泌蛋白的筛选,从中挑出一条表达量较高的基因(KU994904)进行分析,首先进行该基因生物信息学分析,以确定它的主要的功能,命名为金属蛋白酶(metalloproteinase,mep),其次克隆了该金属蛋白酶基因,构建相关原核载体进行体外表达,同时对其亚细胞定位,确定其主要作用位点,为实验室今后进一步研究该蛋白的致病机制奠定了基础。主要取得以下结果:1.生物信息学分析。该金属蛋白酶成熟基因序列长1335bp,编码445个氨基酸,利用在线软件 SignalP4.1 Server、TMpred、big-PI predictor 及 TargetP 1.1 确定此蛋白酶为胞外分泌蛋白,通过NCBI进行比对,其与M36家族中5条序列具有较高相似性,并利用SWISS-MODEL基于同源建模的方法检索PDB(protein data ...

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【学位级别】：硕士

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摘要
abstract
1 引言
    1.1 向日葵种植情况
    1.2 向日葵锈病发生与发布
    1.3 向日葵锈病侵染循环
    1.4 病原菌的致病机制
    1.5 病原菌分泌酶类物质
        1.5.1 蛋白酶
        1.5.2 真菌蛋白酶
        1.5.3 金属蛋白酶
    1.6 生物信息学
    1.7 本研究的目的及意义
2 向日葵锈菌胞外分泌蛋白生物信息学分析
    2.1 数据来源
    2.2 生物信息学分析
        2.2.1 蛋白序列及特征性分析
        2.2.2 蛋白疏水性、跨膜区、信号肽、GPI锚定位点及亚细胞定位分析
        2.2.3 蛋白二三级结构与结构域
    2.3 结果
        2.3.1 蛋白酶基因序列筛选及特征性分析
        2.3.2 蛋白酶疏水性、跨膜区、信号肽、GPI锚定位点及亚细胞定位分析
        2.3.3 蛋白二三级结构与结构域预测
    2.4 结论与讨论
3 金属蛋白酶原核表达
    3.1 材料与方法
        3.1.1 实验材料
        3.1.2 主要仪器
        3.1.3 主要试剂
        3.1.4 培养基的配制
        3.1.5 向日葵锈病菌RNA提取
        3.1.6 cDNA的合成
        3.1.7 基因扩增
        3.1.8 PCR产物纯化
        3.1.9 回收产物与克隆载体连接
        3.1.10 感受态的制备与转化
        3.1.11 重组质粒的筛选
        3.1.12 重组质粒的提取与验证
        3.1.13 目的基因和表达载体pET30a连接
        3.1.14 重组质粒的诱导表达
        3.1.15 菌液放大培养
        3.1.16 蛋白纯化
        3.1.17 亲和层析纯化蛋白
        3.1.18 分子筛层析(SEC)纯化蛋白
        3.1.19 Bradford测定蛋白浓度
        3.1.20 Western-blot检测蛋白
    3.2 结果与分析
        3.2.1 蛋白酶基因扩增及克隆载体构建
        3.2.2 蛋白酶基因表达载体构建
        3.2.3 SDS-PAGE分析鉴定诱导表达结果
        3.2.4 蛋白纯化
    3.3 结论与讨论
4 金属蛋白酶亚细胞定位
    4.1 材料与方法
        4.1.1 实验材料
        4.1.2 主要仪器
        4.1.3 主要试剂
        4.1.4 基因扩增
        4.1.5 目的基因与克隆载体连接
        4.1.6 表达载体构建
        4.1.7 农杆菌GV3101感受态细胞制备
        4.1.8 农杆菌感受态细胞转化
        4.1.9 烟草瞬时表达
    4.2 结果与分析
        4.2.1 金属蛋白酶表达载体构建
        4.2.2 金属蛋白酶成熟基因的烟草瞬时表达
    4.3 结论与讨论
5 结论
致谢
参考文献
作者简介



本文编号：4056491