马铃薯转录因子StPti5表达载体构建及胁迫诱导表达特性分析
发布时间：2020-05-25 00:00
【摘要】：植物生命周期的全过程不可能在完全适宜的环境条件下进行,生物胁迫与非生物胁迫贯穿于植物整个生命周期。转录因子所介导的基因表达调控网络在植物抵御各种胁迫的反应中具有重要功能。AP2/EREBP(APETALA2/ethylene-res ponsive element binding proteins)是一个植物特有的转录因子超家族,其中ERF类属于EREBP转录因子亚族,其主要功能是调节植物对激素(乙烯和ABA等)、病原物和非生物逆境胁迫(低温、干旱及高盐)等的应答反应。前期转录组测序发现马铃薯加湘1号中的一个ERF类转录因子(PGSC0003DMG400010309)在接种晚疫病菌(Phytophthora infestans)24小时后表达量显著上调。为进一步研究转录因子StPti5的功能,本实验克隆了编码StPti5的基因并构建了该基因的植物超表达载体,利用荧光定量的方法分别分析了该基因在生物胁迫(病原菌)和非生物胁迫(高温、低温、干旱和高盐)条件下表达量的变化情况,主要研究结果如下:1、基因克隆和序列分析:以马铃薯加湘1号为材料,根据Spud DB Potato Genomics Resource数据库中PGSC0003DMG400010309基因序列设计引物,并在引物5’端加上BamHI和SalI酶切位点,从加湘1号的RNA中通过RT-PCR扩增获得了加湘1号中的PGSC0003DMG400010309基因,并命名为StPti5,该基因最长开放阅读框为468 bp,编码含156个氨基酸的蛋白。该蛋白的氨基酸序列生物信息学分析结果表明其含有1个典型的AP2结构域,符合ERF类转录因子的结构特征。2、植物表达载体的构建及农杆菌的转化:通过酶切、连接将StPti5基因克隆到表达载体pCAMBIA1301m中。通过测序和酶切验证,证实StPti5基因成功克隆到表达载体中,将其命名为p1301m-StPti5。通过冻融法将p1301m-StPti5转化至根癌农杆菌GV3101中,采用农杆菌花序侵染法进一步将StPti5基因转化拟南芥,潮霉素平板筛选及PCR检测得到4株拟南芥阳性植株。3、胁迫诱导表达分析:分别在接种马铃薯晚疫病菌、高温、低温、干旱、高盐的单一胁迫环境下对马铃薯转录因子StPti5基因进行了实时荧光定量检测,通过对其相对表达量的分析发现,在接种马铃薯晚疫病菌后,StPti5基因在48h内表达量的变化不明显,接种后48h-72h期间,表达量明显上调;在4℃低温下,StPti5基因表达量下调;35℃高温、150mmol/L Nacl高盐溶液中和20%PEG模拟干旱处理下,StPti5基因的表达量先上升后下降。
【图文】：
图 1-1ERF 结构域的结构Fig. 1-1 Structure of the ERF domain等植物中，，有很多编码ERF转录因子的蛋白，例如，在拟南芥基因组中就已知有122个ERF转录因子和139个ERF转录因子（Nakano et al.,类转录因子结合的顺式作用元件一般分为三类：第一类为GCC-box；（DRE: dehydration-responsive element; CRT: C-repeat）；第三类为CC-box，保守序列为AGCCGCC，研究表明其核心序列中的两个G和的结合特异性，当这3个位点的碱基发生替换时会导致GCC-box的低，而其它碱基的结合特性会因互作蛋白的不同而发生变化（Hao eGCC-box广泛存在于病程相关蛋白PR基因的启动子中，这些基因受控植物生物与非生物胁迫，ABA应答、生长发育等不同信号间的互乙烯应答元件。植物的许多抗病相关基因启动子都含有GCC-box。现ERF1/2/3能与GCC-box结合，水稻OsEBP-89也都能与GCC-box结芥转录因子AtERF1/2/3/4/5时发现，AtERF1/2/5对GCC-box比AtERF
图 1-2 ERF 对生物与非生物胁迫响应的调节网络（Singh et al, 2002)ERF response to biological and abiotic stress regulation networks (Singh e许多研究已经发现，当植物处在低温、干旱、高盐等非生物与转录因子起到重要的作用（如表 1-2）。 如下表中，通过对拟南中已知的一些重要的 ERF 转录因子进行克隆并转化受体植物，录因子在不同胁迫条件下能改变植株对逆境的抵抗，有的通过子，可能激发一系列的信号途径，从而使植株既能增强对病原一些非生物逆境的耐受能力。表 1-2 在非生物和生物胁迫中有用的 ERF 基因Table 1-2 ERF genes useful in abiotic and biotic stresses 方法 转基因受体 基因来源 改变的性状 相关基因过量表达 烟草 番茄耐盐性以及抗低温能力都得到提升Wu Zhan过量表达 烟草 番茄抵抗干旱、低温、高盐以及高渗透压的能力大幅提升Wu Wan
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2;S435.32
本文编号：2679205
【图文】：
图 1-1ERF 结构域的结构Fig. 1-1 Structure of the ERF domain等植物中，，有很多编码ERF转录因子的蛋白，例如，在拟南芥基因组中就已知有122个ERF转录因子和139个ERF转录因子（Nakano et al.,类转录因子结合的顺式作用元件一般分为三类：第一类为GCC-box；（DRE: dehydration-responsive element; CRT: C-repeat）；第三类为CC-box，保守序列为AGCCGCC，研究表明其核心序列中的两个G和的结合特异性，当这3个位点的碱基发生替换时会导致GCC-box的低，而其它碱基的结合特性会因互作蛋白的不同而发生变化（Hao eGCC-box广泛存在于病程相关蛋白PR基因的启动子中，这些基因受控植物生物与非生物胁迫，ABA应答、生长发育等不同信号间的互乙烯应答元件。植物的许多抗病相关基因启动子都含有GCC-box。现ERF1/2/3能与GCC-box结合，水稻OsEBP-89也都能与GCC-box结芥转录因子AtERF1/2/3/4/5时发现，AtERF1/2/5对GCC-box比AtERF
图 1-2 ERF 对生物与非生物胁迫响应的调节网络（Singh et al, 2002)ERF response to biological and abiotic stress regulation networks (Singh e许多研究已经发现，当植物处在低温、干旱、高盐等非生物与转录因子起到重要的作用（如表 1-2）。 如下表中，通过对拟南中已知的一些重要的 ERF 转录因子进行克隆并转化受体植物，录因子在不同胁迫条件下能改变植株对逆境的抵抗，有的通过子，可能激发一系列的信号途径，从而使植株既能增强对病原一些非生物逆境的耐受能力。表 1-2 在非生物和生物胁迫中有用的 ERF 基因Table 1-2 ERF genes useful in abiotic and biotic stresses 方法 转基因受体 基因来源 改变的性状 相关基因过量表达 烟草 番茄耐盐性以及抗低温能力都得到提升Wu Zhan过量表达 烟草 番茄抵抗干旱、低温、高盐以及高渗透压的能力大幅提升Wu Wan
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2;S435.32
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本文编号：2679205
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