花椒干腐病菌（Fusarium spp.）的鉴定及其遗传学研究

发布时间：2020-05-26 21:22

【摘要】：花椒树(Zanthoxylum bungeanum)是我国华北至西南等广大地区重要的经济树种,其果壳不仅是亚洲烹饪中常用的香料,也是一味中药(Zhou et al.2016;Tang et al.2014)。干腐病的发生导致中国北方多地花椒树受损,引起枝干枯萎,严重时造成整株花椒树的死亡,严重影响了我国花椒的生产。为了明确花椒干腐病的致病镰刀菌种类与遗传学,针对我国陕西、甘肃、山西、河北和山东省花椒栽培主产区分离的病原菌进行系统发育学、形态学以及生物学鉴定,并对致病菌的生殖方式和线粒体遗传方式进行研究。主要结果如下:1.花椒干腐病镰刀菌鉴定为了鉴定花椒干腐病镰刀菌,在我国陕西、甘肃和山东等5省患病花椒树皮组织中共分离出38株病原菌。对核糖体DNA内转录基因间区(ITS-rDNA)、翻译延伸因子1-α基因(TEF1)、RNA聚合酶II大亚基基因(RPB1)、RNA聚合酶II第二大亚基基因(RPB2)序列的BLASTn比对与系统发育学分析表明,30/38株病原菌为两个镰刀菌系统发育学新种:Fusarium zanthoxyli X.Zhou,T.Aoki,K.O'DonnellZ.M.Cao和Fusarium continuum X.Zhou,T.Aoki,K.O'DonnellZ.M.Cao,与美国佛罗里达榧树(Torreya taxifolia)干腐病病原菌Fusarium torreyae亲缘关系最近。这三个引起木本植物干腐病的病原菌在镰刀菌属内构成了一个新的系统发育分枝,将其定义为榧树镰刀菌复合种Fusarium torreyae species complex(FTOSC)。通过培养性状、显微结构和生长速率的观测,发现花椒干腐病两种病原菌新种在形态特征和最适生长温度方面均有显著差异。研究表明,F.zanthoxyli主要分布在陕西、甘肃和山西省,F.continuum主要分布在山东省。致病性测试表明F.zanthoxyli、F.continuum以及FSSC 6均可以引起凤县大红袍和豆椒两个花椒品种1 2年生枝条腐烂,且F.zanthoxyli和F.continuum在抗病较强的豆椒品种上的致病性显著高于FSSC 6菌种。2.花椒干腐病菌的有性生殖利用CLC基因组工作平台针对F.torreyae、F.lateritium和F.buharicum species complex 3个复合种的11株代表菌株的全基因组数据的MAT位点信息进行BLASTn搜索,结果显示其中有6个MAT1-1交配型菌株和5个MAT1-2交配型菌株。分别对两种交配型菌株的MAT位点进行GATA线性比对,发现MAT1-1-1和MAT1-2-1分别为两种交配型中最保守的基因。依据这两个保守基因设计引物用以筛选交配型。PCR检测表明,5株F.torreyae、30株F.zanthoxyli和5株F.continuum的交配型位点仅包含MAT1-1或MAT1-2之一,揭示这3种镰刀菌为异宗配合菌种。进一步对每个菌种的MAT1-1和MAT1-2菌株进行有性杂交,结果显示30株F.zanthoxyli测试菌株和3/5株F.continuum测试菌株均为母本可育,并在杂交中产生大量成熟赤霉菌(Gibberella)子囊壳。但在5株F.torreyae测试菌株中,仅有1对杂交组合可以产生子囊壳,且大部分子囊流产。在检测的3个杂交温度(22℃,25℃,27℃)中,F.zanthoxyli的子囊壳最适形成温度为22 25℃,F.continuum和F.torreyae的子囊壳最适形成温度为25℃。对3对F.zanthoxyli、3对F.continuum和1对F.torreyae有性杂交组合产生的子代进行基因型检测表明,76% 90%F.zanthoxyli子代、81% 85%F.continuum子代发生基因重组,而仅有36%的F.torreyae子代发生基因重组。有性杂交的成功同时证明了F.zanthoxyli、F.continuum和F.torreyae为3个不同的生物学种。3.花椒干腐病菌的线粒体遗传通过对F.zanthoxyli、F.continuum有性杂交双亲线粒体基因组进行比较,鉴定出包含SNP和InDel的多态性位点,并在标记位点的侧翼设计出PCR引物,用于检测杂交子代线粒体基因型。通过检测F.zanthoyxli NRRL 66714(MAT1-1)×NRRL 66285(MAT1-2)互交子代和F.continuum♀NRRL 66286(MAT1-2)×♂NRRL 66218(MAT1-1)的单向杂交子代的线粒体基因型,揭示两种病原菌子代线粒体均为单亲母系遗传。此外,F.zanthoyxli的互交试验证明线粒体遗传与交配型无关。研究表明F.zanthoxyli、F.continuum两种病原菌的线粒体基因组包含有14个编码与有氧呼吸相关的多肽基因、1个内含子编码的核糖体蛋白基因(rps3)、2个rRNA基因和26 28个tRNA基因,其基因在环形线粒体上的排列顺序与Hypocreales的其他成员一致。F.zanthoxyli双亲线粒体基因组分别为80.9 kb和98.7 kb,F.continuum双亲的线粒体基因组相对较小为63.4 kb。研究表明这两种病原菌线粒体基因组大小上的差异是由于内含子和ORF数量上的不同。
【图文】：

谱系,系统发育学,拓扑结构,分枝

certainty about the limits of species in a single gene genealogy, cited from TPSR 界定物种的主观性的解决方法就是基于多基因的种系一致（GenealogicalConcordancePhylogeneticSpeciesRecognition，，，将不同基因在分析中形成的一致谱系作为物种划分的依据。重组的多个标记位点（multilocus）之间的系统发育树的拓扑扑结构的分枝因没有发生基因重组，是种间的连接枝。拓扑结于分枝个体之间存在基因重组。因此，由相同拓扑结构的分枝换节点是系统发育学种的界定点（图 1-2）。

序列,位点,引物,镰刀菌属

记位点的种系一致性分析（GCPSR）对那些新收集的和已经存在的 Fusari研究，鉴定出 MSR 和 BSR 遗漏的菌种，明确多个复合种的系统发育学关sarium 分类系统产生巨大的影响（ O'Donnell 2000; O'Donnell and Cigelnonnell et al. 1998, 2000a, 2000b, 2004; O'Donnell et al. 2013）。.4.1 应用于 Fusarium 的分子标记应用于真菌种水平的标记位点应选富含内含子的编码蛋白质基因序列，或具多态性（SNP）的位点片段。应用于镰刀菌属系统学研究的分子标记包括：caubulin、mtSSU-rDNA、28S-rDNA、ITS-rDNA、histoneH3、TEF1、IGS、RPB其中 TEF1、RPB1、RPB2 应用广泛，涵盖镰刀菌属所有菌种（Geiser et onnell et al. 2013）。由于 ITS 区相对于 rDNA 上的 5.8S、18S 和 28S 基因有更多的变异，即使是常近的 2 个种都可能在 ITS-rDNA 序列上表现出差异（郑雪松等 2003）。因使得 ITS-rDNA 在种水平的鉴定成为可能。但是许多的镰刀菌在 ITS2 区域源片段，这种现象会影响 Fusarium 的系统发育学推断（O'DonnellandCigelonnell et al. 1998），也影响了 ITS-rDNA 在 Fusarium 中的广泛应用。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.73

【参考文献】