真菌源ABCC转运蛋白对提高植物真菌毒素耐受性的作用研究

发布时间：2020-05-27 01:23

【摘要】：黄曲霉毒素B1(AFB1)、呕吐毒素(DON)和乙酸肉桂酯(CIA)分别是黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus),禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和大刀镰刀菌(Fusarium culmorum),大丽轮枝菌(Verticillium dahlia)等真菌产生的次级代谢物。AFB1和DON极易污染花生和玉米等农产品,进而严重威胁人畜健康及植物生长。而CIA作为黄萎病菌的致病成分之一,也严重影响植物的生长。隔离解毒可有效解决这一问题。植物体内,腺苷三磷酸结合盒(ABC)转运蛋白在有毒物质解毒过程中具有重要作用,该类蛋白可将有毒物质与谷胱甘肽结合形成的轭合物转运至液泡中储存或降解,从而降低有毒物质对细胞的伤害。然而,ABC转运蛋白与AFB1、DON和CIA解毒之间的联系目前尚不清楚。因此,本文以15个拟南芥abcc突变体和来源于黄曲霉及稻瘟病菌的ABC转运蛋白(AfABC和MoMRP)为研究对象,探究了拟南芥ABCC(AtABCCs)、AfABC及MoMRP转运蛋白在提高植物对上述三种真菌毒素耐受性中的作用。主要结果如下:1.拟南芥ABCC单一突变对AFB1的耐受性影响不明显经AFB1处理后,20个不同插入位点的abcc突变体和野生型拟南芥出现相同程度的根伸长被抑制、子叶白化和真叶发黄失绿的表型。这些结果表明,拟南芥ABCC单一突变对AFB1的耐受性影响不明显。2.表达AfABC和MoMRP提高了拟南芥对黄曲霉毒素的耐受性在拟南芥中组成型表达AfABC和MoMRP,分别用AFB1和黄曲霉粗毒素处理,转基因拟南芥的真叶较野生型大,根也明显比野生型长。该结果说明,AfABC和MoMRP增强了拟南芥对黄曲霉毒素耐受性。用AFB1处理AfABC和MoMRP转基因和野生型拟南芥,再转移至不含AFB1的培养基中。检测结果显示,AfABC和MoMRP转基因拟南芥中AFB1的残留量低于野生型。据此推测AfABC和MoMRP通过提高拟南芥对黄曲霉素的降解速度,从而提高了其对AFB1的耐受性。3.抑制谷胱甘肽(GSH)合成,AfABC转基因拟南芥对AFB1耐受性下降向培养基中添加谷胱甘肽合成抑制剂BSO(丁硫氨酸亚砜胺)后,AfABC转基因拟南芥对AFB1的耐受性下降。这说明,GSH参与AfABC提高拟南芥对AFB1的耐受性。4.表达AfABC和MoMRP未能提高拟南芥对CIA和DON的耐受性分别用CIA及DON处理拟南芥。结果显示,转基因拟南芥与野生型之间的生长状态无明显差异。说明异源表达AfABC和MoMRP未能提高拟南芥对CIA和DON的耐受性。进一步观察荧光标记的DON和CIA在根部细胞中的分布和积累,发现转基因拟南芥根细胞中DON和CIA的分布与野生型无明显差异。根据以上结果推测,AfABC和MoMRP可能不参与DON和CIA向液泡的转运。此外,观察到的拟南芥abcc突变体中CIA的分布与野生型也无明显差异。由此推测拟南芥相应ABCC转运蛋白可能也不参与CIA向液泡的转运。以上结果表明,异源表达AfABC和MoMRP能提高拟南芥对黄曲霉毒素的耐受性,不能提高其对DON和CIA的耐受性。AFB1与DON和CIA的转运机制可能不同。
【图文】：

示意图,构象,底物,转换模型

图 1.1ABC 转运蛋白的结构（Kaspar , 2016）（a）ABC 转运蛋白结构域排列（b）NBD 示意图Figure 1.1 Architecture of ABC transporters (Kaspar , 2016)(a) Domain arrangement of ABC transporters (b) Schematic of a single NBD1.2.2 ABC 蛋白的转运机制ABC 转运蛋白的作用模型包括“ATP 转换模型”、“开关模型”、“连续接触模型”和“往复式双通道模型”（Locher, 2016）。“ATP 转换模型”作用机制分为 3 个时期。第 1 时期，TMD 呈“面向细胞内”构象，底物与 TMD 中的“口袋”结合，NBD 连接着 TMD 呈开放式构象；第 1时期至第 2 时期，一旦底物被招募，转运蛋白转为封闭式构象，ATP 与 NBD 结合，NBD 关闭；第 2 到第 3 时期，转运蛋白由“面向细胞质”构象转为“面向细胞外”构象，底物被释放到胞外；最后，转运从第 3 时期回到第 1 时期，NBD 在 ATP 水解和磷酸释放作用下分开，NBD 的转变传递至 TMD，TMD 回到“面向细胞内”构象（Locher, 2016）。“开关模型”作用机制分为 4 个阶段。在第 I 阶段，底物与 TMD 内部高亲和位点结合，起始转运，NBD 对 ATP 的亲和力增强，两个 ATP 分子共同作用结合在

运输模型,磷脂

图 1.2ABC 转运蛋白 ATP 转换物质运输模型（Christopher and Higgins, 2004）Figure 1.2 The ATP switch model for the transport cycle of an ABC transporter (ChristoF.H and Higgins K, 2004)NBD 起源不同，不同的 TMD 底物识别位点也有所不同。因此，ABC 蛋白转运机制可能有所不同。因此，以上任意一种模型可能并不能作为解释所有 A蛋白转运机制的模式。ABC 转运蛋白和 P4-ATPase 均能转运磷脂，，均通过改变转运蛋白构象实现脂的跨膜运输。但二者的转运机制又有所区别。ABC 转运蛋白主要通过水解 A实现 NBD 和 TMD 构象改变进而转运磷脂，而 P4-ATPase 主要通过 ATP 驱动区保守的天冬氨酸（aspartic acid, Asp）残基的磷酸化循环引起 P4-ATPase 构象E1 和 E2 之间相互转变进而转运磷脂（Buch-Pedersen et al., 2009; Kühlbrandt, 2001.2.3 ABC 转运蛋白的分类及功能根据 NBDs 的序列相似性，ABC 转运蛋白可分为 ABCA、ABCB、ABCABCD、ABCE、ABCF、ABCG 和 ABCH 八个家族，如图 1.3。除节肢动物和斑鱼中外，其余生物没有 ABCH 亚族（Wannes and Thomas, 2014）。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S432.44

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