转香樟CcCBFs基因拟南芥抗寒性分析及转录组测序

发布时间：2020-05-31 21:09

【摘要】：低温胁迫是影响植物生长发育的重要非生物胁迫之一,而植物体本身在适应外界环境的过程,形成了一系列应对外界不良环境的应答机制,其中,CBF低温信号转录因子途径在植物的抗寒过程起到举足轻重的作用。香樟(Cinnamomum camphora L.)喜温暖湿润气候,其对低温的适应能力较低,一般温度低于10℃时生长受到抑制,5℃停止生长,0℃冰点时易引起冻害。树体生长时可忍耐短期的零下10℃左右的温度,长时间处于低温易引起落叶甚至树体死亡。而我国北方的冬天漫长而寒冷,严重限制了其在北方地区的推广和园林应用。本研究在实验室前期对香樟CcCBFs(CcCBFa、CcCBFb、CcCBFc和CcCBFd)的研究基础上,以野生型、T2代转香樟CcCBFs基因拟南芥和T3代转香樟CcCBFs基因拟南芥为材料,检测低温胁迫下(4℃)T2代和T3代转香樟CcCBFs基因拟南芥各项生理、生化指标;利用-4℃模拟冻害,检测T3代转香樟CcCBFs基因拟南芥的抗冻性;并利用q-PCR检测低温胁迫6 d时T3代转香樟CcCBFs基因拟南芥抗氧化基因以及晚期胚胎丰富基因的表达水平。从上述生理指标和抗逆相关基因表达水平中筛选出最优增强拟南芥抗寒性的CcCBFc基因。进一步对转香樟CcCBFc基因拟南芥进行转录组测序,分析研究差异表达基因,从中确定CcCBFc基因调控的下游抗寒基因,并推测CcCBFc基因的功能。本研究通过对转香樟CcCBFc基因拟南芥的转录组分析,揭示CcCBFc基因在拟南芥中发挥的抗寒作用的机理,推测该基因在拟南芥抵御低温胁迫的生物学功能。本研究的主要结果如下:1.对T2代转香樟CcCBFs基因拟南芥抗寒生理指标进行测定和分析,结果表明,在低温胁迫处理72 h,转香樟CcCBFa和CcCBFc拟南芥超氧化物歧化酶活性和脯氨酸含量显著高于野生型,且高于转香樟CcCBFb和CcCBFd拟南芥;丙二醛含量显著低于野生型且较转香樟CcCBFb和CcCBFd基因低。可见,CcCBFa和CcCBFc基因可有效增强T2代转基因拟南芥的抗寒性。2.对T3代转香樟CcCBFs基因拟南芥抗寒生理指标进行测定和分析,结果表明,在低温胁迫处理6 d,转香樟CcCBFc的拟南芥过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性和脯氨酸的含量显著高于野生型,且高于其它3个转基因拟南芥;丙二醛含量显著低于野生型,且低于其它3个转基因拟南芥。即CcCBFc基因可明显地提高T3代转基因拟南芥的抗寒能力。3.利用-4℃模拟冻害,观察T3代转香樟CcCBFs基因拟南芥的表型。结果显示,在-4℃处理14 d后,可观察到,野生型拟南芥叶片明显面积减小和萎蔫,植物组织死亡,转香樟CcCBFa、CcCBFb和CcCBFd基因拟南芥叶片呈现不同程度的叶片面积减小和萎蔫,而转香樟CcCBFc基因拟南芥叶片则正常伸展。可见,CcCBFc基因对T3代转基因拟南芥抗冻性的提高同样具有一定的积极作用。4.通过q-PCR检测低温胁迫6 d后T3代转香樟CcCBFs基因拟南芥抗氧化酶基因以及晚期胚胎丰富基因的表达量,其结果显示,外源CcCBFc和CcCBFa基因都可在转基因拟南芥中上调过氧化物酶基因、超氧化物歧化酶基因、抗坏血酸过氧化物酶基因和晚期胚胎丰富蛋白基因的表达水平,从而提高T3代转基因拟南芥对低温的抵抗能力。5.对T3代转香樟CcCBFc基因拟南芥进行转录组测序,结果表明,未低温胁迫时,转香樟CcCBFc基因和野生型拟南芥间植株差异表达基因为2335个,1284个表达上调,其中504个表达显著上调;低温胁迫下,转香樟CcCBFc基因和野生型拟南芥间植株差异表达基因为1125个,364个表达上调,其中152个表达显著上调;对152个表达显著上调的基因进行检索,获得51个与抗寒有关的基因。6.对低温胁迫下T3代转香樟CcCBFc基因和野生型拟南芥间152个表达显著上调的基因检索,发现AP2/ERF、MYB、bHLH、bZIP、Zinc-finger和WRKY等6类与抗寒相关的转录因子参与转香樟CcCBFc基因拟南芥抗寒过程,其中在未低温处理时的转香樟CcCBFc基因拟南芥中,Zinc-finger家族的AT1G30135基因和MYB家族的AT1G18330基因能够被检测表达,这两个基因在低温胁迫下分别参与茉莉酸信号传导通路和乙烯信号传导通路。故推测外源CcCBFc基因可能通过调控AT1G30135和AT1G18330的组成型表达,参与茉莉酸和乙烯信号传导通路,调节茉莉酸和乙烯的合成,从而增强转基因拟南芥的抗寒性。7.对低温胁迫下的T3代转香樟CcCBFc基因和野生型拟南芥间51个与抗寒相关的差异基因分析中,检索出26个热休克相关的基因,推测这26个热休克相关的基因可能与抗寒相关;其中在未低温处理时的转香樟CcCBFc基因拟南芥中有20个热休克相关基因能够被检测表达,对差异基因聚类分析结果表明,转香樟CcCBFc基因拟南芥热休克相关基因相对表达量较野生型高,推测CcCBFc基因可上调热休克相关基因的表达水平,最终发挥抗寒的功能。
【图文】：

转香樟 CcCBFs 基因拟南芥抗寒性分析及转录组测序根据拟南芥响应低温信号通路的特点，滕进婧[74]等人将金柑 MLP2-1 南芥，并对低温胁迫下转基因拟南芥进行转录组测序，根据差异基因 K径推测金柑 MLP2-1 基因可能参与调节植物激素与信号转导代谢途径，因拟南芥的抗冻性。由此可见，对拟南芥低温信号通路的了解是探讨外控转基因拟南芥抗寒性关键环节。

转香樟 CcCBFs 基因拟南芥抗寒性分析及转录组测序3.1.2 T3 代转香樟 CcCBFs 基因拟南芥的获得与鉴定利用植物叶片直接 PCR 试剂盒，分别使用特定引物进行野生型和 T3 代转香樟CcCBFs 基因拟南芥目的基因片段的扩增，结果如图所示：对照野生型均无条带扩出转香樟 CcCBFa、CcCBFb、CcCBFc 和 CcCBFd 基因的拟南芥则分别扩增出相应目的基因条带，，扩增条带均单一且未出现杂带和引物二聚体，初步判断目的基因已整合进入各自拟南芥基因组，每个基因分别获得 4~5 株不等的转基因株系。
【学位授予单位】：南阳师范学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S792.23

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1 王建格;转香樟CcCBFs基因拟南芥抗寒性分析及转录组测序[D];南阳师范学院;2019年

2 张佳佳;香樟CcCBFs基因的表达分析及在模式植物中的功能验证[D];南阳师范学院;2018年

本文编号：2690458