【摘要】：杨树为我国北方一种常见的木材树种,被广泛的作为一种防风固沙的优良树种,具有速生、丰产等特点,可作为建筑材料、造纸和生物能源材料,在陆地生态系统中亦可起到碳汇的作用。但由于杨树木质结构较为疏松、硬度低,且抗压抗弯曲能力较差,制约了杨树的栽培应用。为此本研究以毛白杨(Populus tomentosa Carrière)为实验材料,对4月生长出离地30cm的萌条茎顶端向下分别取不同横截面,观察杨树的维管组织的连续发育过程,通过免疫组织化学标记果胶侧链的变化,利用基因表达变化等分子生物学的相关技术,并结合生物信息学相关分析方法,对毛白杨维管组织发生不同阶段的细胞发育和分子生物学机理进行了探讨,从而明确可能调控维管组织细胞壁发育的PME基因在不同发育阶段表达量高低来揭示杨树木材发育过程中影响木材结构和木材硬度的果胶甲脂酶基因变化的6个相关基因:Potri.014G117100.1,Potri.008G104800.1,Potri.003G076900.1,Potri.004G128900.1,Potri.018G068400.1,Potri.007G015700.1,以上6个基因均可能调节木材硬度变化的果胶甲脂酶基因。本研究为杨树资源进一步开发、利用奠定了基础,本研究主要结论如下:(1)通过对毛白杨萌条的维管组织连续切片观察,发现原形成层-形成层的发育过程是随着茎由上向下逐渐连续进行分化转变的过程。我们把发育时期分为四个阶段,分别为:原生维管组织阶段、发生层阶段、后生维管组织阶段、次生维管组织阶段。从原形成层到形成层分化是同一组织的的不同发育阶段,且该发育阶段是一个连续、渐进的过程。(2)通过对杨树PMEs家族生物信息学分析,共鉴定得到杨树中存在24个PME基因家族成员。染色体分布的定位信息结果表明,除12个基因:Potri.002G145700,Potri.003G076900,Potri.005G012800,Potri.007G015700,Potri.008G104800,Potri.013G008100,Potri.014G117100,Potri.015G110700,Potri.016G017700,Potri.017G054700,Potri.018G068400和Potri.T007200外,其他成员Potri.006G120100,Potri.006G137100,Potri.001G364200,Potri.001G365700,Potri.006G186000,Potri.006G186100,Potri.012G114900,Potri.012G112800,Potri.004G156300,Potri.T007200,Potri.004G128900,Potri.012G115200和Potri.004G033700均位于片段重复或串联重复区域,因此推测这12个成员有可能来源于反转录转座。通过GOEAST对杨树PME基因家族成员功能富集分析,采用KEGG通路分析表明,该家族成员主要富集分布在葡萄糖醛酸转换通路、戊糖、淀粉和蔗糖代谢通路当中。通过进化树分析发现杨树和拟南芥果胶甲酯酶基因家族具有进化上的最大相似性。(3)本研究利用识别果胶不同抗原决定基的四个单克隆抗体(JIM5,JIM7,LM5,LM6),对毛白杨维管形成层发生和活动不同阶段的维管组织进行了免疫组织化学研究。其中,JIM5和JIM7分别用来识别低甲酯化和高甲酯化的HGA,而LM5和LM6则用于识别RG-Ⅰ的半乳聚糖侧链和阿拉伯糖侧链。结果表明,在细胞分裂比较活跃的部位,JIM5标记很少,JIM5多出现在已分化了的木质部或韧皮部细胞的角隅处。伴随茎的向顶发育,这些高甲酯化的果胶被甲酯酶不断地脱甲酯,产生低甲酯化的果胶。这些低甲酯化的果胶细胞在细胞壁上失去分裂活性,逐渐分化成特定的细胞类型之后,就以低甲酯化的形式保留下来,所以在次生维管组织中,形成层区域平周分裂新产生的切向壁几乎看不到JIM5标记信号。新分化的木质部细胞的次生壁没有加厚,其切向壁和部分径向壁看不到JIM5标记信号,只在细胞间的角隅仍有标记信号,而次生韧皮部和次生木质部细胞壁上尤其是角隅处标记强烈。LM5总是标记原生木质部-次生木质部的连续发育过程,同时,LM6总是标记从原生韧皮部-次生韧皮部的连续发育过程,在原形成层细胞开始进行平周分裂以后,果胶分布模式发生变化,因此相应的单克隆抗体JIM5、LM5和LM6可被用作区别原形成层迹阶段和发生层阶段分生组织细胞的标志物。LM5则可用作区别初生韧皮部和次生韧皮部,但始终标记木质部;LM6可以用来区别初生木质部和次生木质部,但在韧皮部始终有标记信号。免疫标记为次生维管组织发育提供了有力的证据,在维管组织最初开始发育时,其韧皮部和木质部细胞壁上的果胶成分就已有区别。(4)为了对HGA甲脂化程度和PME家族基因的表达之间关系作进一步分析。通过切向低温切片法分别对杨树的原生维管组织,发生层,后生维管组织,次生维管组织进行精确取材,使用高通量RNA-seq测序方法来获得调控细胞壁上果胶含量变化的果胶甲酯酶(PMEs)家族基因在不同发育阶段表达量高低。最后筛选出可能调控维管组织发育的PME基因,其中:Potri.014G117100.1,Potri.008G104800.1,Potri.003G076900.1在初生维管组织里的表达量高于次生维管组织,而Potri.004G 128900.1,Potri.018G068400.1,Potri.007G015700.1在每个发育阶段都表达,但在次生维管组织里表达量较高。
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S792.117
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