基于基因组与转录组测序的中国被毛孢功能基因挖掘及生物合成途径研究

发布时间：2025-03-15 03:40

　　冬虫夏草[Ophiocordyceps sinensis(Berk.)Sacc]是线虫草属真菌寄生在蝙蝠蛾幼虫上所形成的虫菌复合体,作为一种传统的名贵中药材在中国已有千年的历史,具有润肺、抗心率不齐、调节和增强免疫力、抗肿瘤等多种药理疗效。近年来,国内外市场对冬虫夏草的需要量剧增,价格飙升,造成人为过度采挖,虫草资源遭到严重破坏,使得人工发酵冬虫夏草菌丝体缓解市场需求迫在眉睫。本文围绕所分离的中国被毛孢菌株在基因组和转录组测序后所得到的功能基因注释信息,对参与侵染过程中的几丁质酶功能基因,对虫草酸、虫草素和虫草多糖的生物合成途径及发酵调控展开了详细的研究和探讨。论文首先研究了从野生冬虫夏草中分离中国被毛孢菌株的过程。从野生冬虫夏草的菌核中分离得到了一株与中国被毛孢菌落形态高度相似的菌株。对此菌株进行电镜观察、形态学和分子生物学鉴定、Biolog鉴定及系统发育树分析,结果表明,所分离菌株的18S rDNA序列与Ophiocordyceps sinensis的18S rDNA序列最高同源性为99%;系统发育树分析发现与Ophiocordyceps sinensis和Hirsutella li...

【文章页数】：157 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
    1.1 引言
    1.2 冬虫夏草中国被毛孢的研究进展
        1.2.1 冬虫夏草的形态学特征
        1.2.2 冬虫夏草的生活史研究
        1.2.3 冬虫夏草产业发展状况
        1.2.4 冬虫夏草的无性型研究
    1.3 冬虫夏草中国被毛孢的主要活性成分及功效
        1.3.1 虫草酸
        1.3.2 核苷
        1.3.3 虫草素
        1.3.4 虫草多糖
        1.3.5 其他活性成分
    1.4 基因组和转录组学测序研究
        1.4.1 基因组测序研究
        1.4.2 转录组测序研究
    1.5 冬虫夏草深层发酵及调控研究
    1.6 冬虫夏草中国被毛孢的侵染过程研究
        1.6.1 体表附着阶段
        1.6.2 体壁穿透阶段
        1.6.3 参与侵染机制的酶
    1.7 本课题的研究目的及主要内容
        1.7.1 选题背景及研究目的
        1.7.2 本研究的主要内容
第二章 中国被毛孢的分离、鉴定及深层发酵
    2.1 引言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 野生冬虫夏草的采集
        2.2.2 培养基、试剂及仪器
        2.2.3 分离组织的萌发
        2.2.4 萌发组织的纯培养
        2.2.5 培养物的菌种鉴定
        2.2.6 18S rDNA序列测定及分析
        2.2.7 中国被毛孢深层发酵
        2.2.8 虫草酸的提取及检测
        2.2.9 核苷类物质的提取及检测
        2.2.10 粗蛋白和总多糖的提取及检测
        2.2.11 氨基酸的提取及检测
        2.2.12 粗脂肪及不饱和脂肪酸的提取及检测
    2.3 结果
        2.3.1 微生物形态学观察
        2.3.2 微生物分子生物学鉴定
        2.3.3 18S rDNA序列系统发育树分析
        2.3.4 Biolog鉴定
        2.3.5 菌丝体中活性成分含量分析
    2.4 讨论
    2.5 本章小结
第三章 中国被毛孢基因组、转录组测序及功能基因挖掘
    3.1 引言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 实验菌株
        3.2.2 实验试剂及培养基
        3.2.3 实验仪器
        3.2.4 中国被毛孢基因组的制备
        3.2.5 中国被毛孢基因组测序
        3.2.6 中国被毛孢基因组序列组装
        3.2.7 中国被毛孢基因组分析
        3.2.8 中国被毛孢总RNA的制备
        3.2.9 中国被毛孢转录组测序
        3.2.10 中国被毛孢转录组分析
        3.2.11 中国被毛孢转录组基因表达注释
        3.2.12 中国被毛孢转录组差异表达分析
        3.2.13 几丁质酶功能基因的挖掘及生物信息学分析
        3.2.14 几丁质酶功能基因的克隆、表达及蛋白纯化
        3.2.15 酶学性质研究
        3.2.16 酶学稳定性、底物特异性及酶学动力学研究
        3.2.17 基因差异表达研究
    3.3 结果
        3.3.1 中国被毛孢基因组原始测序数据处理
        3.3.2 中国被毛孢基因组测序短读序列组装
        3.3.3 中国被毛孢基因组测序ncRNA预测
        3.3.4 中国被毛孢基因组测序重复序列分析
        3.3.5 中国被毛孢基因组测序基因预测
        3.3.6 中国被毛孢基因组测序基因功能注释
        3.3.7 比较基因组学
        3.3.8 中国被毛孢总RNA的制备及检测
        3.3.9 中国被毛孢转录组测序及组装
        3.3.10 中国被毛孢转录组分析
        3.3.11 中国被毛孢转录组功能基因COG分类
        3.3.12 中国被毛孢转录组功能基因GO分类
        3.3.13 中国被毛孢转录组功能基因Pathway注释
        3.3.14 中国被毛孢转录组表达量分析
        3.3.15 几丁质酶功能基因序列分析
        3.3.16 几丁质酶功能基因的克隆、表达及蛋白纯化
        3.3.17 几丁质酶的最适反应温度及温度稳定性研究
        3.3.18 几丁质酶最适反应pH及pH稳定性研究
        3.3.19 金属离子对几丁质酶酶活的影响
        3.3.20 底物特异性及酶学动力学研究
        3.3.21 几丁质酶功能基因的差异表达分析
    3.4 讨论
    3.5 本章小结
第四章 虫草酸和虫草素生物合成途径及发酵调控
    4.1 引言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 实验菌株与载体
        4.2.2 实验试剂及培养基
        4.2.3 实验仪器
        4.2.4 生物合成途径的预测
        4.2.5 生物合成途径的验证
        4.2.6 荧光定量PCR
        4.2.7 基于生物合成途径的发酵调控
        4.2.8 发酵调控后虫草酸产量的检测
        4.2.9 发酵调控后虫草素产量的检测
    4.3 结果
        4.3.1 中国被毛孢虫草酸及虫草素生物合成途径分析
        4.3.2 虫草酸及虫草素生物合成功能基因的扩增
        4.3.3 草酸及虫草素生物合成功能基因重组质粒的构建
        4.3.4 虫草酸及虫草素生物合成功能基因的异源表达
        4.3.5 虫草酸及虫草素功能基因的荧光定量PCR
        4.3.6 虫草酸及虫草素产量的发酵调控
    4.4 讨论
    4.5 本章小结
第五章 基于生物合成途径分析的虫草多糖产量提升
    5.1 引言
    5.2 材料与方法
        5.2.1 实验菌株及培养基
        5.2.2 主要实验试剂
        5.2.3 主要实验仪器
        5.2.4 中国被毛孢的深层发酵
        5.2.5 菌丝体中虫草多糖的提取
        5.2.6 葡萄糖标准曲线的绘制及多糖含量的测定
        5.2.7 虫草多糖中前体单糖的含量检测
        5.2.8 甘露糖生物合成途径预测及验证
        5.2.9 荧光定量PCR引物设计
        5.2.10 甘露糖代谢途径中功能基因的荧光定量PCR
    5.3 结果
        5.3.1 不同金属离子对虫草多糖产量的影响
        5.3.2 不同添加剂量及时间对菌丝体生物量及虫草多糖产量的影响
        5.3.3 培养基pH、剩余糖分、菌丝体生物量及虫草多糖产量的动态监测
        5.3.4 发酵过程中虫草多糖前体单糖的含量变化
        5.3.5 甘露糖生物合成途径的构建及验证
        5.3.6 甘露糖生物合成功能基因的差异表达分析
    5.4 讨论
    5.5 本章小结
第六章 结论与展望
    6.1 结论
    6.2 论文创新之处
    6.3 展望
参考文献
攻读学位期间发表的论文
致谢



本文编号：4035102