对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP110的表达纯化研究

发布时间：2020-04-13 14:50

【摘要】：本文通过对WSSV囊膜VP110序列进行blast和alignment分析后发现,vp110和pif2有相似性,而pif2是杆状病毒经口侵染因子。进一步序列分析发现,VP110和PIF2均在N端有高疏水性区域,且为跨膜区。我们将WSSV VP110与昆虫DNA病毒Baculoviruses、Nudiviruses、Hytrosaviruses等的PIF2蛋白序列最相似的,不包含疏水性较高的N端区域的150到600aa定义为s VP110,将其基因序列克隆到p ET-16b表达载体上。对表达条件如温度、时间、诱导剂浓度和诱导时间进行优化,高表达无断裂的融合蛋白s VP110-His,经GE蛋白纯化仪AKTA Pure系统纯化后,蛋白纯度达到80%以上。复性条件经过不断探索、优化后,选择了最佳复性条件6 mol/L的尿素溶液4℃透析1 h,接着使用4 mol/L尿素溶液透析4 h,最后用2 mol/L尿素溶液透析2 h,成功完成透析复性。使用超滤管超滤浓缩复性成功的蛋白s VP110-His,得到高浓度、高亲水性的s VP110-His蛋白,浓度达到600.83 mg/m L,总量完全满足制备兔源多克隆抗体的要求(≥3mg)。将制备成功的融合蛋白s VP110-His作为抗原免疫兔子,成功的制备出特异性高,亲和性好的多克隆抗体,抗体的效价达到1:23,000。这为进一步验证WSSV的经口侵染以及VP110与围食膜蛋白的相互作用打下了基础。我们将VP110功能区域(150aa-610aa)构建到载体p QE80-ZZtev、p ET-16b、p GEX-4T1和p ET-32a,经过对原核表达的条件的摸索:如改变诱导温度、尝试低温表达、诱导时间延长及缩短、诱导剂浓度的摸索(1 mmol/L、0.1 mmol/L);尝试不同的表达菌株BL21、Rosetta和Origami B;最终用N端带有提高蛋白可溶性的硫氧还原蛋白标签和两端均有用于纯化的his标签的p ET-32a载体,成功的表达出可溶性融合蛋白s VP110-Trx,并对其进行了纯化优化摸索,得到可溶性的融合蛋白s VP110-Trx。本文在研究过程中,尝试表达VP110全长蛋白。选用了不同的表达载体、不同表达菌株,并对表达条件进行优化。结果表明,VP110全长以包涵体形式表达。上清中含量极微或者完全检测不到。三种表达菌株BL21、Rosetta和Origami B中,Rosetta的表达能力最好,BL21次之,Origami B最差。三株菌的最适表达条件均为1 mmol/L的IPTG和30℃的诱导温度。三个不同标签的表达载体p GEX-4T1、p ET-16b、p ET-32a中,p ET-32a的融合蛋白VP110-Trx的表达量在同样条件下最高,p ET-16b的融合蛋白VP110-His的表达量次之,p GEX-4T1的融合蛋白VP110-GST表达量最低。尽管优化表达后,VP110始终以包涵体的形式表达,然而,我们是首次获得VP110全长表达。
【图文】：

1 对虾白斑综合征病毒简介对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus，，WSSV)1992 年发现于台湾，随后在中国[1]、日本[2]、韩国[3]、泰国[3]、印度[4]、美国[5]、法国[6]等世界各国都有暴发，给水产养殖业带来了巨大的经济损失如图 1 所示[7]。

图 2 有白色斑点的 WSSV 侵染的斑节对虾的甲壳（a）和腹段最后部分（b）Fig. 2 White spot syndrome virus infected Penaeus monodon showing white spot symptoms oncarapace (a) and last abdominal segment (b)WSSV 是 Nimaviridae 科 Whispovirus 属的唯一种[10, 11]，双链 DNA 病毒，上传的基因组序列有中国台湾株(WSSV-TW)[12]、大陆株(WSSV-CN)[13]、泰国株(WSSV-TH)[14]和韩国株(WSSV-KR)[15]，基因组大小约 300 kb，是海洋病毒最大基因组之一。WSSV 病毒粒子外形像杆状大约有 210-420nm，内有 19nm 厚的核衣壳，外有 6-7nm 厚的囊膜包裹，病毒粒子的一端有类似尾的附着器[16, 17]。2 对虾白斑综合征病毒研究进展2.1 对虾白斑综合征病毒环境控制研究进展WSSV 的宿主主要是甲壳类动物，宿主生活环境在无论是淡水还是海水，其
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S945.1

【共引文献】

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本文编号：2626111