温度胁迫对多鳞白甲鱼AMPK介导的能量稳态及脂肪酸代谢的影响

发布时间：2020-05-05 07:03

【摘要】：水温作为一种重要的环境因子,直接或间接地影响鱼类的繁殖、发育、生长和代谢等生理过程。当前气候多变,极端天气的出现经常导致水温突然改变,从而对鱼类产生温度胁迫,影响其存活和生长,降低鱼类养殖经济效益,甚至可能造成巨大经济损失。因此,本研究通过克隆获得多鳞白甲鱼AMPK家族基因的完整CDS,全面分析温度胁迫下多鳞白甲鱼血清和组织中的腺苷酸水平、能量物质含量和脂肪酸组成,以及AMPK与其调控的脂肪酸代谢相关基因表达和酶活力的变化,系统研究温度胁迫下多鳞白甲鱼能量稳态及脂肪酸代谢的变化规律,为阐明鱼类对温度变化的适应策略,以及建立和优化缓解温度胁迫对鱼类不利影响的人工养殖技术提供理论依据。试验一多鳞白甲鱼AMPK家族基因的克隆及生物信息学分析。通过克隆获得多鳞白甲鱼AMPK家族基因的完整CDS,进行氨基酸多序列比对发现,多鳞白甲鱼AMPKα1(MG720299.1),AMPKα2(MG720300.1),AMPKβ1(MG720301.1),AMPKβ2(MG720302.1),AMPKγ1(MG720303.1),AMPKγ2(MG720304.1)和AMPKγ3(MG720305.1)分别包含1713 bp,1659 bp,783 bp,801 bp,993 bp,1605 bp和1014 bp的完整CDS,编码了570,552,260,266,330,534和337个氨基酸;系统进化树分析表明这些氨基酸序列与鲤科鱼类,如鲤、斑马鱼,尤其与我国特有的渻亚科鱼类,如金线渻(Sinocyclocheilus grahami),具有高度的相似性(92.44%~97.95%),结构域均比较保守。此外,多鳞白甲鱼AMPK家族7个基因在心脏、肝脏和肌肉中的mRNA表达水平均较高,可能与这些组织中比较旺盛的能量代谢十分相关。试验二低温胁迫促进多鳞白甲鱼能量消耗,增强脂肪酸β-氧化,抑制脂肪酸合成,并改变机体脂肪酸组成。在低温胁迫(10℃)不同时间点(0h,1h,3h,6h,12h,24h,48h),检测多鳞白甲鱼血清以及肝脏、肌肉等样品中腺苷酸(ATP,ADP,AMP),甘油三酯(TG)、游离脂肪酸(NEFA)、总胆固醇(T-CHO)、葡萄糖(GLU)和总蛋白(TP)的含量,组织脂肪酸组成,肝脏和肌肉中AMPKα以及脂肪酸代谢相关基因的mRNA表达及酶活力的变化。结果显示,血清和肌肉中AMP/ATP值显著升高(P0.05),血清和肝脏的AEC值均低于0.75;血清和肝脏中GLU的含量均先升高,然后降低,血清中TG的含量在3h后显著下降(P0.05),NEFA的含量先升高,3h后逐渐降低,而T-CHO和TP含量变化不显著,肝脏中NEFA的含量也随时间推移逐渐降低;肌肉中单不饱和脂肪酸(MUFA)的比例随时间逐渐降低,而n-3系列高不饱和脂肪酸(n-3 HUFA)的比例呈上升趋势;肝脏中AMPKα2的mRNA表达水平随时间推移逐渐升高,肌肉中AMPKα1和AMPKα2的mRNA表达水平均在48h显著升高(P0.05),然而其活力的变化均不显著,肝脏中ATGL的mRNA表达水平升高,但无显著性差异,ACC2和CPT1A的mRNA表达水平显著升高,而肝脏和肌肉中ACC1和FAS的mRNA表达水平均显著降低(P0.05)。研究表明,低温胁迫(10℃)下,多鳞白甲鱼持续消耗能量,能量稳态失衡,可能激活AMPK,动员能量物质代谢尤其增强脂肪酸β-氧化,抑制脂肪酸合成;同时,肌肉中MUFA的比例降低,这可能与其优先被氧化供能有关,而n-3HUFA的比例随时间推移而增加,这可能与其参与维持膜流动性,保证细胞膜的正常功能相关。试验三高温胁迫促进多鳞白甲鱼脂质水解及脂肪酸β-氧化,抑制脂肪酸合成,并影响其脂肪酸组成。在高温胁迫(30℃)不同时间点(0h,1h,3h,6h,12h,24h,48h),检测多鳞白甲鱼肝脏和肌肉等样品中NEFA的含量和脂肪酸组成以及脂肪酸代谢相关基因在mRNA水平上的表达变化。结果显示,高温胁迫(30℃)下,多鳞白甲鱼肝脏和肌肉中的NEFA含量先升高,随着时间推移逐渐减少;肌肉中饱和脂肪酸(SFA)的比例在12h显著降低(P0.05),n-3 HUFA的比例也呈下降趋势,其中主要是二十二碳六烯酸(DHA)的比例降低;肝脏中ATGL和HSL的mRNA表达水平升高,同时,CPT1A和PPARα的mRNA表达水平也显著升高,而FAS和SREBP-1的mRNA表达水平显著降低(P0.05)。研究表明,高温胁迫(30℃)促进了多鳞白甲鱼脂质水解并增强脂肪酸β-氧化,抑制脂肪酸合成;此外,肌肉脂肪酸组成也发生改变,主要表现为n-3 HUFA的比例随时间推移而减少。综上所述,本研究克隆获得多鳞白甲鱼AMPK家族7个基因的完整CDS,并发现温度胁迫下,多鳞白甲鱼持续消耗能量,能量稳态失衡,可能激活AMPK,进而通过调控脂肪酸代谢相关基因的表达促进脂质水解及脂肪酸β-氧化供能,抑制脂肪酸合成,以减少能量消耗;此外,脂肪酸组成也发生适应性的改变,以避免温度胁迫对机体产生危害。
【图文】：

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第一章文献综述1.1 AMPK 与能量稳态1.1.1 AMPK 简介腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK），是一个调控机体能量稳态的重要的异源三聚体蛋白，组成它的亚基有 α、β 和 γ 三种（图 1-1）（Garcia andShaw 2017）。其中，α 亚基发挥催化作用，其 N-端是行使功能的核心部位，含有一个典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域；作为调节亚基，β 亚基包含一个碳水化合物耦联结构域（CBM），主要参与调节糖代谢；γ 亚基的 C-端含有 4 个串联重复排列的 CBS框，2 个 CBS 框串联在一起，构成一个具有二聚体结构的 Bateman 结构域，主要感知AMP/ATP 比例的变化，进而发挥调控作用（Hardie et al. 2012; Xiao et al. 2011）。AMPK能感知机体能量状态的变化，并通过调控物质代谢的多个环节来维持细胞能量的供求平衡。

通路图,能量代谢,机体,影响机体

P/ATP 值升高，从而激活 AMPK，并影响机体能量代谢。一方面，AMPK 可以糖原、脂肪和胆固醇的合成等减少 ATP 的消耗，另一方面，，AMPK 可以通过酸氧化、葡萄糖转运等增加 ATP 的生成（图 1-2），从而维持机体能量稳态。因PK 也被称为机体的 “能量感受器”或“能量开关”（Frederich et al. 2009; Hardmoto 2006; Hardie et al. 2012）。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4

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