维氏气单胞菌TH0426株主要保护性抗原的筛选及表达OmpF重组乳酸菌的构建和免疫效果评价

发布时间：2020-05-05 07:20

【摘要】：维氏气单胞菌(Aeromonas veronii,AV)是多数水生动物的病原菌之一,在某些条件下也可引起人类感染发病。因此,研发新型重组疫苗可有效的降低养殖业的经济损失。由于抗生素耐药性及感染鱼类后可快速传播等问题,在水产养殖中接种疫苗仍是最有效的预防细菌感染鱼类的方式之一。在与细菌毒力相关的多种毒力因子中,由于外膜蛋白(outer membrane protein)暴露于菌体表面且与细菌致病性密切相关,被广泛地应用于疫苗开发研究中。本文以维氏气单胞菌TH0426为研究对象,通过质谱分析对该菌株具有潜在性的蛋白质进行分析。首先,将灭活的维氏气单胞菌与佐剂混合后免疫健康鲤鱼,间隔2周免疫一次,在第二次加强免疫后采集血清。结果显示,经SDS-PAGE与Western blot检测该菌株具有多种具有免疫原性的蛋白质;此外,通过质谱分析鉴定出39个具有反应原性的蛋白质,其分子量范围在102.83-25.09 kDa之间。其次,在质谱分析鉴定的基础上,对维氏气单胞菌TH0426株的OmpF基因进行了扩增、克隆及测序分析,利用分子生物学技术,构建了表达A.veronii TH0426 OmpF基因的原核表达载体。此外,利用乳糖操纵子启动的大肠杆菌/乳酸菌穿梭表达载体p PG612表达OmpF基因,以鲤鱼肠源干酪乳杆菌作为表达外源基因的递呈载体,并通过SDS-PAGE与Western blot进行鉴定。结果显示,经PCR扩增克隆出Omp F基因并成功构建了重组质粒p PG612-OmpF,此株重组乳杆菌表达约45 kDa蛋白且具有良好的反应原性。为评估构建的重组乳杆菌L.casei/pPG612-OmpF的免疫保护效果及有效诱导免疫反应的能力,本研究应用重组乳杆菌口服免疫鲫鱼,并进行攻毒保护性试验。将重组菌L.casei/pPG612-OmpF经乳糖诱导后包被于颗粒饵料免疫鲫鱼,每隔2周免疫一次,共免疫3次,每次连续免疫3 d。在免疫前与免疫后第1、7、12、17、21、31及38 d采集血清样品和脏器组织样品,检测血清及组织中相关免疫指标的变化;在免疫前与免疫后第1、3、5、7、12、16及20 d收集鲫鱼肠道清洗液,检测重组乳杆菌在鲫鱼肠道定植情况。采用ELISA方法分别检测免疫鲫鱼血清中IgM、Ig T、IL-8及IFN-γ含量。结果表明,重组乳杆菌L.casei/pPG612-OmpF能在前肠中有效定植数天,在免疫7天后前肠中菌落数处于最高水平,且定植数量高于中肠和后肠;经ELISA法检测免疫前后不同时间血清中IgM含量,结果显示免疫重组乳杆菌L.casei/pPG612-Omp F的鲫鱼在加强与再次加强免疫后产生较高的IgM水平;此外,血清中相关细胞因子IgT、IL-8及IFN-γ的表达水平在加强免疫后处于上调趋势,与对照组差异显著,初步说明重组菌可增强鲫鱼的体液免疫。最后,通过RT-PCR检测鲫鱼不同组织中免疫相关基因(IL-1β,IL-10,TNF-α,IFNγ)的表达情况。结果显示,免疫重组乳杆菌L.casei/pPG612-OmpF后,鲫鱼心、肝及头肾中的IL-1βmRNA相对表达量有所提升;重组乳杆菌L.casei/pPG612-OmpF组中IL-10的相对表达量在心、肝、脾、头肾及肠道中呈上调趋势;随着时间推移,在免疫21天后,心、脾、头肾及肠道中的TNF-α基因转录水平持续增强;在首免5天后,IFNγ的mRNA相对表达量在心、肝、脾及头肾中显著上升,表明重组乳杆菌分泌的外膜蛋白可能刺激肠道淋巴组织分泌相关细胞因子,进而提升鲫鱼的免疫反应水平。经腹腔注射A.veronii TH0426 1.×106CFU/尾,结果表明,重组乳杆菌L.casei/pPG612-Omp F组鲫鱼的免疫保护率为51.43%,对照组鲫鱼全部死亡,免疫重组乳杆菌能减缓A.veronii的感染,具有一定的保护作用。本研究构建了表达A.veronii TH0426株OmpF基因重组干酪乳杆菌,利用重组乳杆菌免疫鲫鱼后可诱导鱼类产生特异性IgM抗体及体液免疫反应,可保护鲫鱼抵抗A.veronii的侵袭及感染。综上所述,经黏膜途径免疫重组活载体L.casei/pPG612-OmpF是一种潜在抗维氏气单胞菌感染的疫苗候选。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S941.4
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本文编号：2649749