鸡雌雄种蛋气味、多组学基质差异及无损鉴别研究

发布时间：2020-08-24 07:39

【摘要】：在蛋鸡孵化行业中,无损鉴别早期种胚蛋性别,既能满足实际生产需求,又可避免鸡蛋资源的大量浪费。鉴于此,本课题在采用无损方式对不同品种、不同受精状态和雌雄种胚蛋气味组成进行差异分析和筛选潜在标记物的基础上,进一步借助高通量组学技术和生物信息学分析手段来解析雌雄种蛋差异机制;最后,初步建立了两种气味无损鉴别种蛋性别的方法模型。主要研究进展或结果如下:(1)SMPE-GC-MS无损检测种蛋气味的优化条件为:DVB/CAR/PDMS在40°C下,萃取60 min,共鉴定到挥发物(VOCs)17/18种。随机森林分类(RFC)和典型判别(CDA)对三个品种种蛋VOCs判别准确率均高达100%;CDA交叉验证准确为83.3%,说明所建模型对种蛋品种判别效果较好。其中,庚醛、己醛、癸醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2-乙基-1-己醇等VOCs对种蛋品种区分贡献较大;2-乙基-1-己醇和2-壬烯-1-醇为白莱航种蛋所特有化合物;3-溴乙基-哌啶和2-氰基-乙酰胺为京粉1号种蛋所特有组分。即这些差异物质可能成为无损鉴别种蛋品种的潜在靶标物。(2)SPME-GC-MS和E-Nose成功地用于无损判别鸡蛋受精情况,其中,CDA模型对GC-MS法无损鉴别鸡蛋受精状态的判别正确率为100%;对E-Nose无损鉴别鸡蛋受精与否和受精成败的判别正确率分别为:100%和89.5%。雪松烯、癸醛、己醛、2-乙基-1-己醇和十一醛等对区分鸡蛋授精与否(UF-Fd)贡献较大;雪松烯和癸醛对未授精蛋和受精失败种蛋(UF-IF)区分贡献较大;庚醛和十一醛等对种蛋受精成败(F’-IF)区分贡献较大,可能成为鉴别未受精蛋的潜在标记物。传感器P40/1、P10/2、P10/1、TA/2和T40/2等对区分鸡蛋授精与否(UF-Fd)贡献较大;T30/1、P30/1、P40/2、PA/2和T40/2等对区分种蛋受精成败(F’-IF)贡献较大。(3)孵化早期(E_0-E_9,W)雌雄鸡种胚蛋和不同品种(W、H、J)雌雄鸡种蛋VOCs组成均存在一定差异;CDA模型对孵化早期雌雄种胚蛋判别正确率接近100%(丰度,52/52;相对含量51/52);对不同品种雌雄鸡种蛋的判别准确率分别为:W,100%(丰度)、90%(相对含量);H,68.8%(丰度)、76.6%(相对含量);J,90.4%(丰度,相对含量)。孵化早期,雌性种胚蛋VOCs有效丰度高于雄蛋;2-乙基-1-己醇(E_0)、雪松烯、庚醛和壬醛(E_1)、二氧化碳(E_5)、辛醛(E_7,E_9)等VOCs与白莱航种胚蛋性别具有一定相关性。2-壬烯-1-醇、2-乙基-1-己醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮和己烷等VOCs对W种蛋性别区分贡献较大;壬醛、2-壬烯-1-醇、1-辛醇、十七烷胺和6-甲基-5-庚烯-2-酮等VOCs对H种蛋性别区分贡献较大;雪松烯、癸醛和十一醛等VOCs对J种蛋性别区分贡献较大。(4)在雌雄种蛋中共鉴定到脂质900种,差异脂质76种,上调(FM)3种、下调73种;在雌雄种蛋中表达差异较大脂质有:酰基肉碱、甘油三酯(TG,12:0/22:1/22:3)、溶血磷脂酰丝氨酸(LPS,16:0/0:0)、神经酰胺(Cer,d18:0/18:0)、胆固醇脂(CE,16:1)、磷脂酰胆碱(PC,O-18:3/20:4)等;在雌雄种蛋中共鉴定到代谢物582种,差异代谢物72种,上调46种、下调26种;在雌雄种蛋中表达差异较大代谢物有:δ-戊内胺、(±)11,(12)-环氧-5Z,8Z,14Z-二十碳三烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、2-吡咯烷酮、9-氧代-10E,12Z-十八碳二烯酸、顺式-7-十六碳烯酸、异烟酰胺、甲酰四氢叶酸等。差异代谢物参与较多的通路有:酪氨酸、嘌呤代谢、不饱和脂肪酸合成、代谢和维生素降解、吸收等。此外,参与性激素代谢通路的雌酮3-硫酸盐和参与禽蛋主体VOCs醛类形成的枯茗醛,可能雌雄种蛋气味差异存在较大关联,值得重点关注。(5)雌雄种蛋黄氨基酸中谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸和精氨酸存在较小的显著性差异,但整体组成相似。从雌雄种蛋黄中共鉴定到411种蛋白质;其中276个归属为物种鸡,其余135蛋白可能为物种鸡的假设“新蛋白”;筛选到35个差异蛋白,在雄性种蛋中表达上调(MF)的18种,下调(MF)的17种。其中,37533205(免疫球蛋白轻链V-J区)、1015809562(卵黄蛋白原-2)、763550308(免疫球蛋白轻链)、973583714(抗前列腺免疫球蛋白)和1741943(免疫球蛋白重链)等差异蛋白质对种蛋性别区分贡献较大。差异蛋白主要分布于胞外,参与免疫和应激等生物过程,具有结合和化学诱导活性;差异蛋白参与程度较高的生物过程或通路主要包括:免疫球蛋白生产、免疫应答分子调节、应激和免疫应答。下调的差异蛋白主要涉及遗传信息折叠、分类和降解、环境信号分子互作、细胞生长与死亡、运输和分解代谢等功能;上调的差异蛋白在KEGG注释率较低。(6)所建模型对采用GC-MS和PTR-MS法无损鉴别种蛋性别的拟合顺序为:MLPCDARFC;其中MLP模型对鸡种蛋性别鉴别(训练)准确率分别为100%和91%。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS253.1
【图文】：

鸡胚,性别决定,机制,染色体

图 1-1 鸡胚性别决定和早期分化机制（J and Ca 2011,Kota and Feil 20101-1 Sex determination and sexual differentiation in early chicken embryo 注（a-鸡卵母细胞减数分裂；b-鸡胚性别早期分化）性别决定机制色体决定学说W 染色体显性假说：鸡胚性别由母本提供的 W 染色体决定，即配子发育成雌胚，ZZ 型发育成雄胚（Uller and Badyaev 2009）。Z 染色体剂量效应：除 W 染色体携带性别决定基因外，Z 染色体基因（DMRT1），即父本提供的两条 Z 染色体中 DMRT1 基因在异；高、低剂量 Z 连锁基因诱使鸡胚发育为雄雌两性。此外，三W）鸡的存在，也支持该假说（Lin et al 1995,詹小舒等 2016）细胞决定学说

细胞识别,鸡胚,性别,机制

图 1-2 鸡胚性别细胞识别机制（Zhao et al 2010）Fig.1-2 Sex identied by (male and female) cells in chickena-雌雄嵌体鸡实物图；b-鸡性别细胞识别和哺乳动物性别决定机制；c-嵌体鸡血细胞性染色体-嵌体鸡雌雄两侧雌雄细胞的组成比例）减数分裂决定学说ller 等（Uller and Badyaev 2009）认为，母体中环境因子可通过卵子形产生隐微变异来影响性别决定，即在减数分裂Ⅰ期，可通过染色体（纺畸变、退化和位移实现；在减数分裂后期排卵前，可通过性别特异性吸收等实现（图 1-3a）。此理论有望将禽类性别决定起点提前至减数分1-1a，图 1-3a）（Alonso-Alvarez 2006,Uller and Badyaev 2009）。着减数分裂对禽类性别决定影响被逐步发现和证实，Uller 等（Uller aev 2009）提出环境、自然选择诱导减数对性别调控进化过程，大致可分：①基因调节为主，减数分裂调节偶然出现为辅；②基因调节为辅，

性别决定,鸡蛋,减数分裂,机制

图 1-3 鸡蛋形成及减数分裂对性别决定的影响机制（Aslam and Woelders 2017,Uller andBadyaev 2009）Fig.1-3 Formation of eggs and conceptual overviewof the proposed evolutionary relationshipamong the genetic sex-determination module, regulatory mechanisms of meiosis and oogenesis,and female reproductive homeostasis注（a-鸡蛋形成过程；b-减数分裂对性别决定的影响）1.1.4 其他相关学说除性染色体外，有学者认为，鸡细胞中部分常染色体存在性别决定候选基因，如与芳香化酶表达高度相关的 FOXL2（Govoroun et al 2004）。综上可知，鸡的性别由基因和环境等众多因子共同决定，而非某一单独模块起作用；因此，我们应该运用系统生物学和高通量组学等方法，从不同的侧面和层面，以整体的视觉来研究鸡的性别决定机制（何川和孟和 2011）。1.2 鸡胚性别分化

【参考文献】