焦磷酸盐引起的猪肉肌球蛋白结构变化对TGase交联反应的影响

发布时间：2020-09-30 14:14

　　 谷氨酰胺转移酶(TGase)已广泛应用于肉制品加工中,催化肌肉蛋白中谷氨酰胺(Gln)与赖氨酸(Lys)残基发生酰基转移反应,形成高粘性的蛋白凝胶网络结构,改善肉制品的品质。其交联效果与底物蛋白结构密切相关,然而肌肉蛋白的结构会因贮藏、运输和加工中的蛋白氧化及肉制品中磷酸盐的添加而发生改变,可能改变TGase可利用的Gln和Lys残基含量,故可能影响TGase交联模式。本实验以猪外脊肉提取的肌球蛋白和肌原纤维蛋白为研究对象,以Fenton羟自由基氧化系统(FeC1_3/L-抗坏血酸/H_2O_2,pH 6.25)为模型,进行TGase交联(E:S=1:20),研究焦磷酸盐引起的猪肉肌球蛋白结构变化对TGase交联反应的影响,主要研究内容及结果如下:研究焦磷酸钠(TSPP)引起猪肉肌球蛋白结构变化对TGase交联程度的影响发现:对于未经TSPP处理( TSPP)肌球蛋白,随着H_2O_2浓度(1~50 mmol/L)增加,头部的两个活性巯基SH1和SH2被封闭程度显著增加(P0.05),表面疏水性呈现先增加后降低的趋势,α-螺旋结构的含量由48.74%降至44.51%。TSPP处理(+TSPP)在一定程度上减弱SH1和SH2的氧化修饰程度,显著降低肌球蛋白的表面疏水性(P0.05),α-螺旋结构的含量增加至49.83%,说明TSPP在氧化过程中能更好的保护肌球蛋白的二级结构。TGase交联会导致α-螺旋结构显著减少(P0.05),表面疏水性显著增加(P0.05),且变化程度在经TSPP处理后进一步加深。TGase交联引起的α-螺旋结构的相对变化量与氧化程度有关:对于 TSPP样品,轻度氧化(1 mmol/L H_2O_2)未氧化重度氧化(30和50 mmol/L H_2O_2);对于+TSPP样品,随着H_2O_2浓度增加而逐渐增加。自由氨基和SDS-PAGE结果显示,TSPP能够促进TGase催化下的交联程度。研究TSPP引起的肌球蛋白结构变化对TGase交联的活性底物Gln残基的影响发现:对于 TSPP样品,未氧化时TGase交联的活性底物Gln残基位于S1(Gln-613)和LMM(Gln-1498),而重度氧化时(50 mmol/L H_2O_2),S1(Gln-613)不再是TGase交联的活性位点;对于+TSPP样品,未氧化时TGase交联的活性底物Gln残基位于S1(Gln-558和Gln-613)、S2(Gln-1361和Gln-1373)、LMM(Gln-1422/Gln-1425和Gln-1498),而重度氧化时Gln-1361不再是TGase交联的活性位点。研究TSPP对氧化猪肉肌原纤维蛋白的TGase交联程度及凝胶性能的影响发现:无论是否添加TSPP,随着H_2O_2浓度的升高,肌原纤维蛋白凝胶的储能模量(G')和凝胶强度均逐渐降低,加入TGase后均有所回升,且增幅随着H_2O_2浓度升高逐渐降低。相对于 TSPP样品,+TSPP条件下未氧化样品的G'和凝胶强度增幅更高,分别达到72.19%和63.11%,但氧化时增幅降低速度更快。这说明,虽然TSPP处理有利于TGase交联引起的凝胶性能提高,但当受到氧化胁迫时,TSPP处理反而对其不利。分析TGase交联程度、蛋白结构与凝胶性能之间的相关性发现:对于 TSPP样品,氧化和TGase引起的交联程度和凝胶性能变化与氨基酸修饰和二级结构显著相关(P0.05),而对于+TSPP样品,这些变化不再与二级结构变化相关。可见,在TSPP条件下,TGase交联程度和蛋白凝胶性能与二级结构的相关性被弱化。综上所述,本课题阐明了TSPP引起的猪肉肌球蛋白结构变化对TGase交联程度及交联后蛋白凝胶性能的影响,揭示了影响TGase交联和产品品质的结构因素,为TGase及其他交联酶类在肉制品中的应用及产品品质控制提供了理论依据。
【学位单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TS251.1
【部分图文】：

间的相互作用构成了肌肉的运动。1.2.2 肌球蛋白图1-1 骨骼肌肉中肌球蛋白分子示意图Fig. 1-1 Schematic diagram of myosin in skeletal muscle肌球蛋白分子量约为500 KDa，在肌原纤维蛋白中占43%，它由两条肌球蛋白重链（MHC）和四条肌球蛋白轻链（LC）组成。每条MHC在胰凝乳蛋白酶的作用下可以水解为重酶解肌球蛋白（HMM）、轻酶解肌球蛋白（LMM）、亚片段1（S1）和杆部Rod。HMM在木瓜蛋白酶的作用下进一步水解为S1和亚片段2（S2），结构如图1-1所示（Xiong，1997）。通过SDS-PAGE电泳分析得知，MHC分子量为205 KDa，三条LC分子量分别为：16 KDa、18 KDa和22 KDa，HMM分子量为140 KDa

12两个蛋白质片段和一个α-氨基丁酸（Uchida et al，1990）。图1-2 蛋白氧化的常见结果Fig. 1-2 The most common consequences of oxidation of proteins半胱氨酸和甲硫氨酸由于含有硫原子，易受羟自由基攻击转化为二硫化合物或硫代过氧自由基（Schoneich and Christian，2008），造成蛋白质的交联。Houghten和L（i1979）、Dean等（1997）指出，这些物质是不稳定的，可通过还原剂（β-巯基乙醇或二硫苏糖醇）还原为半胱氨酸或甲硫氨酸。而其他氨基酸需要更严格的条件才能被氧化修饰（Zhang etal，2013）。李银等（2013a）也证实了这一说法，肌原纤维蛋白中半胱氨酸、甲硫氨酸及酪氨酸对·OH的敏感程度显著大于天冬氨酸、甘氨酸及亮氨酸。羰基化合物的是氨基酸侧链氧化修饰的最常见产物，通常用来衡量蛋白的氧化程度。羰基通常由以下四个途径生成：（a）通过α-酰胺化途径和β-部位的骨架断裂；（b）蛋白质氨基酸侧链

焦磷酸盐引起肌球蛋白结构变化对 TGase 交联程度S-PAGE 电泳进行分析。2 mg/mL 的蛋白液与含合，煮沸 3 min，每孔进样 15 μL。然后凝胶.8%冰乙酸的溶液染色 40 min，随之用含 5%甲凝胶用 GE 的 AI600 超灵敏多功能成像仪成像均为 3 次重复的平均值。数据处理使用 StatisSD 法），不同显著性数据用不同字母标记。球蛋白氧化程度的影响

【参考文献】

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本文编号：2830943