古菌DNA聚合酶的克

发布时间：2025-05-13 05:53

　　DNA聚合酶是普遍存在于生物体内执行DNA复制的关键酶。随着分子生物技术的飞速发展,越来越多的DNA聚合酶被发现并逐渐应用于包括PCR、定点诱变、高通量测序在内的生物学研究。在众多的DNA聚合酶中,来自B族的古菌DNA聚合酶因为具有良好的热稳定性、超群的保真性、一定的可加工性而受到越来越多研究者的欢迎。本文所研究的来自超嗜热古菌Thermococcus kodakarensis的KOD DNA聚合酶就属于这一家族,但市售的KOD DNA聚合酶产品大多来自于国外的公司,受到进口和专利等限制,价格较为昂贵。因此,开发出一种具有优良特性且价格有优势的KOD DNA聚合酶就显得尤为重要。本文利用Escherichia coli重组表达了KOD DNA聚合酶并对其生物活性进行了表征;同时通过定点突变的方法构建了KOD DNA聚合酶突变体,也对其生物活性进行表征;对重组KOD DNA聚合酶在PCR的应用过程中,通过添加了解旋酶或分子伴侣素的方法,构建PCR复合酶体系,针对PCR反应特异性、储存稳定性、损伤修复性进行研究,研究结果表明:在E.coli中表达出的重组KOD DNA聚合酶浓度最高可达5.4...

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图1.1 KOD DNA聚合酶-模板-d ATP三元复合物晶体结构[18]

KODDNA聚合酶的蛋白质结构可分为几个部分,5’-3’聚合酶活性部分执行酶的催化聚合功能,3’-5’外切酶活性部分实行校对功能。KODDNA聚合酶可分为以下几个结构域,N端(N-terminal)由第1-130,327-368位氨基酸组成;外切酶结构域(exonucleas....

图2.1 KOD DNA聚合酶CDS

从NCBI中获取KODDNA聚合酶基因的CDS(蛋白质编码序列),共2325bp,如图2.1,利用NEBcutter2.0等软件对目的基因进行分析设计,于基因5’端设计酶切位点NdeⅠ(CATATG),于基因3’端设计酶切位点BamHⅠ(GGATCC),拟将该基因插入至pE....

图2.2 KOD DNA聚合酶基因优化后序列

根据E.coli表达偏好性,针对KODDNA聚合酶基因进行优化,图2.2为合成公司反馈的优化结果。2.3.2重组KODDNA聚合酶的表达

图2.3 IPTG诱导表达KOD DNA聚合酶

重组KODDNA聚合酶的表达结果如图2.3所示。箭头指示为目标蛋白。诱导前与诱导后对比结果显示,诱导后的菌体在94kDa下方多了一条明显的条带,而目的蛋白大小约为91kDa,说明KODDNA聚合酶在经过IPTG诱导后有明显特异性表达;总蛋白与上清液中蛋白含量的对比显示,....

本文编号：4045841