腺苷单磷酸功能化纳米材料的生物毒性评估及肿瘤靶向成像

发布时间：2017-03-19 19:00

  本文关键词：腺苷单磷酸功能化纳米材料的生物毒性评估及肿瘤靶向成像，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：降低纳米材料的毒性及提高纳米材料靶向肿瘤能力是纳米材料研究领域的重要内容。本文以生物相容性小分子腺苷单磷酸(AMP)为配体,考察了其转水相量子点的生物毒性,并系统鉴定了其介导纳米材料在体内外水平上靶向结肠癌及乳腺癌模型的性能和机制。首先,我们考察了AMP转水相量子点的生物毒性。以AMP为配体通过转水相方式制备AMP-QDs,以J774A.1细胞为模型,发现其成像性能优于MPA-QDs。且MTT结果显示AMP-QDs的细胞毒性小于MPA-QDs。以BALB/c小鼠为模型,发现AMP-QDs主要分布在肝、肾中,长时间点(60 d)检测发现,量子点并不能完全从小鼠体内代谢出去。通过组织切片及免疫因子检测等,发现AMP-QDs没有对小鼠产生明显的免疫毒性作用。其次,我们初步考察了AMP转水相量子点对结肠癌CW-2细胞及乳腺癌MDA-MB-468细胞的靶向作用。结果表明：AMP可以介导量子点有效靶向CW-2及MDA-MB-468,提示AMP具有作为癌细胞靶向配体的潜能。为了进一步探索AMP引导纳米材料靶向肿瘤的性能和机制,我们从下面三方面展开了系统的研究工作：(1)AMP功能化聚合物荧光纳米材料的制备及表征将AMP与1,6-己二胺偶联制备带活性氨基的AMPHDA,并合成了聚合物荧光纳米材料(NPs),其在可见区(峰值在594 nm)和近红外区(峰值在777 nm)均可发荧光。将AMPHDA与NPs偶联制备NPs-AMP。纳米材料水合粒径由53 nm (NPs)增至57 nm(NPs-AMP), NPs-AMP几乎完全保持了NPs的荧光强度。(2)AMP功能化聚合物荧光纳米材料对结肠癌的靶向研究首先,我们以结肠癌CW-2细胞为模型,考察了NPs-AMP对结肠癌细胞CW-2的靶向作用。结果表明：NPs-AMP可高选择性靶向CW-2,而对肠上皮细胞(IECs)靶向作用微弱。NPs-AMP首先靶向CW-2细胞膜,随着时间延长,NPs-AMP被CW-2内化入细胞质。RT-PCR及Western blot方法发现：CW-2相对于IECs可高表达腺苷A1受体(A1R,1832倍)。细胞免疫荧光实验和RNA干扰实验表明：A1R在介导NPs-AMP靶向CW-2细胞中发挥了关键作用。通过NPs-AMP对更广谱的结肠癌细胞(包括SW620、Lovo及HCT116)的靶向能力实验及A1R表达量测试实验,发现NPs-AMP具有靶向多种结肠癌细胞的能力,且这种靶向能力与A1R表达量呈现正相关关系。然后,我们以种植CW-2移植瘤的裸鼠为模型,考察了NPs-AMP在活体水平上对结肠癌模型的靶向作用。结果表明：NPs-AMP可有效靶向CW-2肿瘤,材料荧光信号在肿瘤部位的聚集比例由20.5%(NPs)上升为41.6%(NPs-AMP)。此外,肿瘤组织免疫荧光实验表明,NPs-AMP能进一步介导纳米材料进入到肿瘤组织细胞内部。(3)AMP功能化聚合物荧光纳米材料对乳腺癌的靶向研究首先,我们以人乳腺癌MDA-MB-468细胞为模型,考察了NPs-AMP对乳腺癌细胞MDA-MB-468的靶向作用。结果表明：NPs-AMP可高选择性靶向MDA-MB-468细胞,而对乳腺上皮细胞(MECs)靶向作用微弱。NPs-AMP首先靶向MDA-MB-468细胞膜,随着时间延长,NPs-AMP被MDA-MB-468内化入细胞质。RT-PCR实验结果表明：MDA-MB-468相对于MECs可高表达A1R(870倍)。细胞免疫荧光实验及RNA干扰实验结果表明：A1R介导了NPs-AMP靶向MDA-MB-468细胞。通过NPs-AMP对更广谱乳腺癌细胞(包括HS578T.T47D及MDA-MB-458)的靶向能力实验及A1R表达量测试实验,发现NPs-AMP具有靶向多种乳腺癌细胞的能力,且这种靶向能力与A1R表达量呈正相关关系。然后,我们以MDA-MB-468移植瘤的裸鼠为模型,考察了NPs-AMP在活体水平上对乳腺癌的靶向作用。结果表明：NPs-AMP可有效靶向MDA-MB-468肿瘤,材料荧光信号在肿瘤部位聚集比例由15.7%(NPs)上升为31.8%(NPs-AMP)。此外,肿瘤组织免疫荧光实验表明,NPs-AMP能进一步介导纳米材料进入到肿瘤组织细胞内部。综上,一方面,AMP赋予纳米材料低的免疫毒性,这为将来设计生物相容性纳米材料提供了参考；另一方面,AMP作为肿瘤靶向配体成功介导纳米材料在体内外水平上靶向结肠癌及乳腺癌,这为将来设计基于配体AMP的肿瘤诊断与治疗药物提供了借鉴,为将来潜在的临床应用提供了依据。
【关键词】：腺苷单磷酸 生物毒性 乳腺癌 结肠癌 纳米材料 靶向
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114;TB383.1
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-15
• 第1章 文献综述15-37
• 1.1 纳米技术15
• 1.2 量子点15-19
• 1.2.1 量子点的合成15-16
• 1.2.2 量子点生物医学光学成像16-18
• 1.2.3 量子点的风险评估18-19
• 1.3 聚合物包覆的有机纳米材料19-21
• 1.3.1 聚合物包覆的有机纳米材料制备方法20
• 1.3.2 聚合物包覆的有机纳米材料荧光成像20-21
• 1.4 被动靶向21-22
• 1.4.1 被动靶向的定义21
• 1.4.2 被动靶向的建立21-22
• 1.5 主动靶向22-28
• 1.5.1 主动靶向的基本原则22
• 1.5.2 配体偶联与黏附策略22-23
• 1.5.3 纳米材料结构对主动靶向的影响23-26
• 1.5.4 生物标志物及靶向配体26-28
• 1.6 腺苷及腺苷受体28-33
• 1.6.1 腺苷28-29
• 1.6.2 腺苷受体与癌症29-33
• 1.7 结肠癌与乳腺癌及其生物标志物33-35
• 1.7.1 结肠癌及其生物标志物33-34
• 1.7.2 乳腺癌及其生物标志物34-35
• 1.8 本论文研究内容及意义35-37
• 第2章 AMP转水相量子点的生物毒性评估37-53
• 2.1 引言37
• 2.2 实验材料37-38
• 2.2.1 实验药品与试剂37
• 2.2.2 实验仪器及技术服务37-38
• 2.2.3 实验细胞、动物及引物38
• 2.3 实验方法38-42
• 2.3.1 AMP转水相量子点的制备38-39
• 2.3.2 量子点的表征39
• 2.3.3 细胞培养39
• 2.3.4 量子点的巨噬细胞成像39-40
• 2.3.5 MTT法分析量子点的细胞毒性40
• 2.3.6 RT-PCR法检测细胞免疫因子40-41
• 2.3.7 量子点的体内生物分布及免疫毒性41-42
• 2.4 实验结果与讨论42-52
• 2.4.1 量子点的表征42-44
• 2.4.2 量子点的巨噬细胞成像44-45
• 2.4.3 量子点的体外毒性分析45
• 2.4.4 量子点的体外免疫毒性分析45-48
• 2.4.5 量子点的体内分布与毒性分析48-52
• 2.5 本章小结52-53
• 第3章 AMP转水相量子点靶向癌细胞的初步研究53-57
• 3.1 引言53
• 3.2 实验材料53
• 3.3 实验方法53-54
• 3.3.1 量子点靶向结肠癌细胞53
• 3.3.2 量子点靶向乳腺癌细胞53-54
• 3.4 实验结果与讨论54-56
• 3.4.1 AMP介导量子点靶向结肠癌细胞54-55
• 3.4.2 AMP介导量子点靶向乳腺癌细胞55-56
• 3.5 本章小结56-57
• 第4章 AMP功能化聚合物荧光纳米材料的制备与表征57-69
• 4.1 引言57
• 4.2 实验材料57-58
• 4.2.1 实验药品与试剂57
• 4.2.2 实验仪器及技术服务57-58
• 4.3 实验方法58-60
• 4.3.1 AMPHDA的制备58
• 4.3.2 聚合物荧光纳米材料的制备58-59
• 4.3.3 配体功能化聚合物荧光纳米材料的制备59
• 4.3.4 聚合物荧光纳米材料的表征59-60
• 4.3.5 聚合物荧光纳米材料生物安全性评价60
• 4.3.6 聚合物荧光纳米材料活体成像性能初探60
• 4.4 实验结果与讨论60-68
• 4.4.1 AMPHDA合成的检测60-62
• 4.4.2 AMP功能化聚合物荧光纳米材料合成路线62
• 4.4.3 AMP功能化聚合物荧光纳米材料的表征62-66
• 4.4.4 AMP功能化聚合物荧光纳米材料生物安全性评价66-67
• 4.4.5 聚合物荧光纳米材料活体成像初探67-68
• 4.5 本章小结68-69
• 第5章 AMP功能化聚合物荧光纳米材料靶向结肠癌细胞的研究69-87
• 5.1 引言69
• 5.2 实验材料69-70
• 5.2.1 实验药品与试剂69-70
• 5.2.2 实验仪器及技术服务70
• 5.2.3 实验细胞及引物70
• 5.3 实验方法70-75
• 5.3.1 肠上皮细胞的分离培养70-71
• 5.3.2 流式细胞仪检测纳米材料靶向癌细胞71
• 5.3.3 激光共聚焦检测纳米材料细胞定位71-72
• 5.3.4 RT-PCR法检测癌细胞与正常细胞基因表达差异72
• 5.3.5 Western blot法检测癌细胞与正常细胞基因表达差异72-73
• 5.3.6 细胞免疫荧光法分析纳米材料与受体共定位73-74
• 5.3.7 受体抑制剂实验探讨纳米材料靶向机制74
• 5.3.8 受体基因沉默实验探讨纳米材料靶向机制74-75
• 5.3.9 纳米材料靶向不同种类的结肠癌细胞75
• 5.4 实验结果与讨论75-86
• 5.4.1 肠上皮细胞的分离培养75-76
• 5.4.2 纳米材料靶向结肠癌细胞76-78
• 5.4.3 激光共聚焦检测纳米材料的细胞定位78-79
• 5.4.4 RT-PCR法检测受体基因表达量79-80
• 5.4.5 Western blot法检测受体基因表达量80
• 5.4.6 免疫荧光法检测纳米材料与受体共定位80-81
• 5.4.7 受体抑制剂实验探讨纳米材料靶向机制81-82
• 5.4.8 基因沉默实验探讨纳米材料靶向机制82-84
• 5.4.9 纳米材料靶向不同种类的结肠癌细胞84-85
• 5.4.10 不同配体介导纳米材料靶向不同的生物标志物85-86
• 5.5 本章小结86-87
• 第6章 AMP功能化聚合物纳米材料靶向结肠癌移植瘤的研究87-96
• 6.1 引言87
• 6.2 实验材料87
• 6.3 实验方法87-89
• 6.3.1 裸鼠的饲养87
• 6.3.2 裸鼠结肠癌移植瘤模型的建立87-88
• 6.3.3 纳米材料的活体成像88
• 6.3.4 纳米材料在活体内的组织分布88
• 6.3.5 移植瘤的免疫组织化学分析88-89
• 6.4 实验结果与讨论89-94
• 6.4.1 不同大小瘤块对纳米材料体内靶向成像的影响89-92
• 6.4.2 纳米材料在体内的组织分布92-93
• 6.4.3 移植瘤的免疫组织化学分析93-94
• 6.5 本章小结94-96
• 第7章 AMP功能化聚合物荧光纳米材料靶向乳腺癌细胞的研究96-109
• 7.1 引言96
• 7.2 实验材料96
• 7.3 实验方法96-99
• 7.3.1 乳腺上皮细胞的分离培养96-97
• 7.3.2 流式细胞仪检测纳米材料靶向乳腺癌细胞97
• 7.3.3 激光共聚焦检测纳米材料在乳腺癌细胞的定位97-98
• 7.3.4 RT-PCR法检测乳腺癌细胞与正常乳腺细胞基因表达差异98
• 7.3.5 免疫荧光法检测纳米材料与乳腺癌细胞受体共定位98-99
• 7.3.6 基因沉默实验探讨纳米材料对乳腺癌细胞的靶向机制99
• 7.3.7 纳米材料靶向不同种类的乳腺癌细胞99
• 7.4 实验结果与讨论99-108
• 7.4.1 乳腺上皮细胞的分离培养99-100
• 7.4.2 纳米材料靶向乳腺癌细胞100-102
• 7.4.3 激光共聚焦检测纳米材料在乳腺癌细胞中的定位102-103
• 7.4.4 RT-PCR法检测乳腺癌细胞受体基因表达量103-104
• 7.4.5 免疫荧光法检测纳米材料与乳腺癌细胞受体共定位104-105
• 7.4.6 基因沉默实验探讨纳米材料靶向乳腺癌细胞的机制105-107
• 7.4.7 纳米材料靶向不同种类的乳腺癌细胞107-108
• 7.5 本章小结108-109
• 第8章 AMP功能化聚合物荧光纳米材料靶向乳腺癌移植瘤的研究109-117
• 8.1 引言109
• 8.2 实验材料109
• 8.3 实验方法109-111
• 8.3.1 裸鼠乳腺癌移植瘤模型的建立109
• 8.3.2 纳米材料的活体成像109-110
• 8.3.3 纳米材料在活体内的组织分布110
• 8.3.4 乳腺癌移植瘤的免疫组织化学分析110-111
• 8.4 实验结果与讨论111-115
• 8.4.1 纳米材料在乳腺癌移植瘤模型中的靶向成像111-112
• 8.4.2 纳米材料的组织分布112-113
• 8.4.3 乳腺癌移植瘤的免疫组织化学分析113-115
• 8.5 本章小结115-117
• 第9章 总结与展望117-121
• 9.1 主要结论117-119
• 9.2 课题创新点119-120
• 9.3 课题展望120-121
• 参考文献121-130
• 攻读博士学位期间撰写的论文130-131
• 致谢131

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