甜菜黑色焦枯病毒侵染本生烟后复制场所的形态发生及诱导寄主反应的机制

发布时间：2016-11-21 05:46

  本文关键词：甜菜黑色焦枯病毒侵染本生烟后复制场所的形态发生及诱导寄主反应的机制，由笔耕文化传播整理发布。

《中国农业大学》 2015年

甜菜黑色焦枯病毒侵染本生烟后复制场所的形态发生及诱导寄主反应的机制

曹修岭  

【摘要】：植物病毒中很大一类属于正义RNA病毒,正义RNA病毒在侵染过程中都会在寄主细胞的内膜系统上形成各种的复制场所以完成病毒RNA的复制。虽然关于正义RNA病毒复制场所的研究已经开展了较多的工作,但是对复制场所的形成机制仍有待深入研究。本研究以单链正义的甜菜黑色焦枯病毒(Beet black scorch virus, BBSV)为研究材料,对其侵染本生烟后复制场所的定位、形态发生以及三维结构进行了研究,并对参与BBSV复制的未折叠蛋白反应(Unfolded protein response, UPR)和相关的寄主因子进行了探究。 首先,通过激光共聚焦显微镜(CLSM)观察到BBSV侵染的本生烟中内质网(ER)形成了聚集体,同时透射电子显微镜(TEM)观察发现感染BBSV的细胞中内质网发生了重塑,形成了交叠卷曲状结构,并且内质网膜凹陷形成了很多小泡结构(spherules)。利用双分子荧光互补实验(BiFC)也证实BBSV p23-p82复合体可以特异的与ER聚集体共定位。此外,利用免疫胶体金分别检测BBSV的复制辅助蛋白p23以及dsRNA中间体,结果表明p23可特异的定位在ER膜上以及小泡结构上,而dsRNA可以在小泡结构上被特异的检测到。以上结果说明,BBSV侵染本生烟后形成的内质网小泡结构是BBSV的复制场所。 将p23蛋白在本生烟叶片中瞬时表达,CLSM观察结果显示表达p23的细胞中伴随有ER聚集体的形成,且与p23蛋白共定位。进一步TEM观察结果表明p23的表达能够引起ER发生卷绕和聚集。与此相反,在本生烟中表达BBSV编码的其他蛋白并没有看到ER发生上述类似的形态变化。说明p23蛋白是BBSV侵染过程中诱导内质网膜重塑的关键蛋白,但单独表达p23并不能诱导形成类似病毒侵染的复制小泡结构。通过膜浮选实验(membrane flotation assay)和构建p23缺失突变体证明p23蛋白是膜锚定蛋白,其N端的跨膜区不仅对于p23的内质网定位有决定性作用,而且对于其重塑内质网的能力也是必需的。 本文还利用电子断层成像和三维重构技术对BBSV的复制场所进行了三维重构和渲染,这在植物病毒中尚属首次报道,与已报道的动物病毒在内质网上形成复制场所的三维结构相比,有其自身的特点。通过三维重构结果发现,病毒的复制小泡和胞质能够通过一个直径约5-7nm的小管相连通。另外,病毒诱导形成的泡包(vesicle packets)之间也是可以连通的。此外,我们也对复制泡中的丝状结构进行了三维渲染,结果显示其形态呈现多样性。BBSV复制场所的三维结构不仅为研究BBSV的复制提供了新的视野,也为研究其他病毒的复制场所提供了有价值的参考。 本研究中,无论是通过PVX病毒载体还是35S启动子表达p23蛋白都能够引起本生烟注射叶片发生坏死,而这种细胞坏死作用可以通过过表达BiP蛋白来抑制,说明p23过表达引起的细胞坏死与寄主的未折叠蛋白反应(UPR)存在相关性。Northern blot分别检测BBSV侵染本生烟后不同时间点6个不同UPR相关基因(bZIP60, BiP, PDI, CRT, CAM和SKP1)的表达水平,结果表明不同UPR基因的表达调控呈现时间依赖性。利用TRV-VIGS沉默UPR通路的关键基因bZIP60后,BBSV在本生烟中的积累量发生明显下降,且BBSV侵染细胞中形成的内质网聚集体数量明显减少,说明UPR在BBSV侵染过程中发挥重要作用,对维持病毒正常侵染是必须的。这也是植物病毒中首次报道病毒复制辅助蛋白可以诱发UPR。 最后,对BBSV复制过程中所需的寄主因子进行了研究,初步结果表明BBSV的侵染可以诱导热激蛋白Hsp70和Hsp90表达量的升高,而下调Hsp70和Hsp90的表达后能够严重影响BBSV在本生烟中的复制。后续利用BiFC和GST pull-down实验证明p23蛋白能够分别与Hsp70和Hsp90直接互作,说明Hsp70和Hsp90直接参与了BBSV病毒RNA的复制。关于Hsp70和Hsp90如何参与BBSV的复制还有待于后续的深入研究。

【关键词】：
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S432.41
【目录】：

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