宿主蛋白NPM1、EB3和HSP47对PEDV复制影响

发布时间：2016-11-23 12:11

  本文关键词：宿主蛋白NPM1、EB3和HSP47对PEDV复制影响，由笔耕文化传播整理发布。

《中国农业科学院》 2015年

宿主蛋白NPM1、EB3和HSP47对PEDV复制影响

石达  

【摘要】：一般来说病毒感染后,宿主对病毒侵染最初的应答是天然免疫应答,如细胞凋亡、炎性反应和抗病毒免疫分子分泌等,通过这些免疫机制,宿主可以拮抗病毒的入侵,或者为宿主建立获得性免疫应答赢得时间从而最终清除入侵的病毒。但是,很多病毒在长期进化的过程中获得了避免细胞过早凋亡和抑制炎症反应的能力,从而得以在宿主体内大量增殖,最终导致疾病的发生。冠状病毒(Coronavirus, CoVs)这一大类病毒广泛存在于自然界中,常见禽类、哺乳动物以及人类都易感。自2003年SARS-CoV(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus, SARS-CoV)的流行到2012年的MERS-CoV (Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus, MERS-CoV)的出现,引起了全世界人类的恐慌,2010-2013年猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)在世界大范围肆虐更是重创了世界畜牧业,至此,人们才对冠状病毒感染后致病的严重程度以及快速的传播能力给予了足够的重视。PED是由套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒亚科(Coronavirinae) α、冠状病毒属(Alphacoronavirus)的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的,该病是猪的一种急性、高度接触传染性的肠道疾病,以严重的肠炎、呕吐、水样腹泻和脱水为主要特征,各种日龄的猪均易感,尤其是哺育仔猪,发病率有时高达100%,死亡率为30-80%。因此,开展PEDV复制机制相关的基础研究具有重要性,在解析冠状病毒的复制机制方面更有普遍的借鉴意义。本研究在对PEDV N蛋白核定位特性研究的基础上,进一步利用免疫共沉淀和GST-pull down试验发现并证实PEDV N蛋白和NPM1蛋白存在相互作用,并通过激光共聚焦试验发现,N蛋白和NPM1蛋白共定位于细胞的核仁中。随后通过GST-pull down方法对两者相互作用结构域进一步鉴定,发现N蛋白aal47-294与NPM1蛋白的aa189-294是两者相互作用的必需区域,并且NPM1蛋白的K263R突变可以促进N和NPM1的相互作用。在探索NPM1蛋白在N蛋白核仁定位的作用中发现N蛋白的核仁定位并不依赖NPM1蛋白的核质穿梭功能。在研究NPM1蛋白对病毒复制的作用中发现,在PEDV感染的细胞中NPM1蛋白的表达显著上调。同时发现过表达NPM1蛋白时,可促进N蛋白的表达和PEDV的增殖;相反,利用靶向NPM1蛋白的特异性干扰小RNA分子沉默PEDV易感细胞内源性NPM1蛋白的表达,N蛋白的表达和PEDV的增殖均受到抑制。进一步对其分子机制研究发现N蛋白和NPM1蛋白相互作用使其免于被切割,上调细胞的抗凋亡能力,避免细胞过早凋亡,进而促进病毒的复制。病毒从感染宿主细胞开始,宿主和病毒无时无刻不在相互作用。为了筛选与PEDV相互作用的宿主蛋白,本研究应用酵母双杂交系统和GST-pull down技术分别发现PEDV M蛋白和宿主蛋白EB3以及非结构蛋白NSP7和宿主蛋白HSP47之间存在相互作用。随后我们进一步用免疫共沉淀,激光共聚焦试验证明了PEDV M蛋白和宿主蛋白EB3以及非结构蛋白NSP7和宿主蛋白HSP47之间确实存在相互作用。有趣的是,在研究NSP7和HSP47蛋白共定位时发现,单独表达NSP7和HSP47蛋白时,发现NSP7蛋白定位在宿主细胞的细胞核中,HSP47蛋白分布在宿主细胞的细胞质中,然而当NSP7和HSP47蛋白共同表达时,两者共定位在宿主细胞的细胞核周边,说明两者的相互作用改变了这两种蛋白的亚细胞分布。本研究中另一项重要的内容是PEDV M蛋白和宿主蛋白EB3以及非结构蛋白NSP7和宿主蛋白HSP47相互作用是否影响PEDV的复制,以及影响PEDV复制的分子机制。研究发现PEDV M蛋白和宿主蛋白EB3以及非结构蛋白NSP7和宿主蛋白HSP47相互作用对PEDV复制的影响正好是对立的,在PEDV感染的细胞中,EB3蛋白表达显著增加,并且我们通过转染表达有EB3蛋白真核表达重组质粒来上调Vero E6中内源性的EB3蛋白,通过检测M蛋白的表达情况和TCIDso测定,结果显示可以促进M蛋白的表达并且显著增强PEDV的增殖。而病毒非结构蛋白NSP7和宿主蛋白HSP47相互作用对病毒复制的影响正好相反,研究发现在PEDV感染48h和60h,HSP47蛋白表达显著降低,进一步通过转染表达有HSP47蛋白真核表达重组质粒来上调Vero E6中内源性的HSP47蛋白,发现显著抑制病毒N蛋白表达以及PEDV的增殖。M和EB3以及NSP7和HSP47相互作用影响PEDV复制的分子机制有待进一步研究。

【关键词】：
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

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