双峰驼精清诱导排卵分子调控机制的研究
发布时间：2025-03-17 21:28
双峰驼(Camelus Bactrianus)是生存于荒漠和半荒漠草原地带的古老物种,是我国重要的优势畜种资源,具有重要的经济和科研价值。由于双峰驼是严格的季节性发情动物,其生长速度慢、生殖周期长、繁殖性能低,而且双峰驼排卵机理尚不清楚,故而本研究以双峰驼为研究对象,展开蛋白质组及差异蛋白功能的研究。首先,我们选取繁殖季节和非繁殖季节双峰驼(公驼)血清,通过蛋白质组学(i TRAQ)筛选出与生殖相关的差异蛋白,利用生物信息学及分子生物学进一步筛选和鉴定与激素合成分泌相关的差异蛋白-视黄醇结合蛋白(Retinol-Binding Protein 4,RBP4),并通过体外细胞模型验证RBP4蛋白的功能;其次,通过i TRAQ技术筛选肌肉注射精清(Seminal Plasm,SP)诱导排卵后的卵巢组织差异表达蛋白质;利用内分泌学、组织形态学、影像学及分子生物学进一步筛选出可能参与调控诱导排卵的靶蛋白-钙离子/钙调依赖性蛋白激酶II-γ(Calcium/calmodulin kinase II-γ,CAMK2G);最后,通过体外卵巢颗粒细胞模型研究CAMK2G对雌激素受体(ER)的调控机制。本...
【文章页数】：154 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Summary
英文缩略表
第一章 综述
1.骆驼的生殖生理
1.1 骆驼的分类及分布
1.2 骆驼的生殖特性
1.3 骆驼生殖生理
2 视黄醇及其代谢过程
2.1 视黄醇与动物生殖
2.2 视黄醇结合蛋白RBP的研究进展
2.3 视黄醇结合蛋白的作用机理
2.4 视黄醇结合蛋白在生殖疾病方面的研究
3 钙离子及其代谢过程研究进展
3.1 钙离子的功能
3.2 钙离子与生殖
3.3 钙离子与钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ
3.4 钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ的生理功能
3.5 钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ与生殖相关疾病的关系
4 本实验的研究目的意义及创新点
第二章 双峰驼血清差异蛋白的筛选与鉴定
前言
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 试剂及仪器
1.3 方法
1.3.1 血清蛋白的提取
1.3.2 过滤辅助样品制备(FASP)消解
1.3.3 iTRAQ标记和SCX分馏
1.3.4 LC-MS/MS分析
1.3.5 数据分析
1.3.6 血清RNA的提取及qPCR反应
1.3.7 总蛋白的提取及蛋白免疫印迹
1.3.8 统计与分析
2 结果分析
2.1 双峰驼血清iTRAQ分析
2.2 鉴定差异表达蛋白
2.3 聚类分析和蛋白质间互作网络(PPI)分析
2.4 qPCR和 Western blot验证表达谱
3 讨论
4 小结
第三章 维生素A结合蛋白(RBP4)对AR的影响
前言
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
1.2.1 细胞原代培养
1.2.2 体外细胞处理和转染
1.2.3 实时荧光定量PCR
1.2.4 免疫组织化学染色
1.2.5 免疫荧光染色
1.2.6 统计分析
2 结果
2.1 RBP4 基因在双峰驼各组织的mRNA检测
2.2 RBP4在双峰驼性腺轴的检测
2.3 不同浓度VitA对其受体,结合蛋白(RBP4)及IGFs的影响
2.4 RBP4过表达载体的构建及其酶切鉴定
2.5 支持细胞转染过表达p-EGFP-RBP4 的效果检测
2.6 过表达RBP4对IGFs及类固醇激素合成的影响
2.7 siRNA-RBP4 的合成及沉默效率检测
2.8 沉默RBP4对IGFs及类固醇激素合成通路的影响
3 讨论
4 小结
第四章 双峰驼精清诱导排卵后卵巢差异蛋白质筛选
前言
1 材料和方法
1.1 试剂耗材
1.2 方法
1.2.1 动物和处理条件
1.2.2 精液收集和精清制备
1.2.3 精清注射及血清样品收集
1.2.4 样品的采集
1.2.5 qRT-PCR和 RT-PCR
1.2.6 蛋白质印迹
1.2.7 组织免疫荧光染色
1.2.8 数据分析
2 结果分析
2.1 卵泡直径和血清激素水平
2.2 蛋白质分析
2.3 差异表达蛋白的鉴定
2.4 蛋白质-蛋白质互作网络(PPI)分析
2.5 表达谱验证
2.6 组织表达分析
3 讨论
4 小结
第五章 CAMK2G通过类固醇通路调控ER的表达
前言
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
1.2.1 不同浓度抑制剂处理细胞
1.2.2 细胞转染及其它方法
2 结果
2.1 CAMK2G的表达分析
2.2 过表达载体p-EGFP-CAMK2G酶切验证
2.3 双峰驼颗粒细胞转染过表达p-EGFP-CAMK2G的效果检测
2.4 过表达CAMK2G对各受体的影响
2.5 过表达CAMK2G对类固醇激素合成通路的影响
2.6 siRNA-CAMK2G沉默效率的检测
2.7 敲低CAMK2G对各受体及PPI各相关蛋白的影响
2.8 敲低CAMK2G对类固醇激素合成通路的影响
2.9 抑制剂KN-93对CAMK2G的影响
2.10 抑制剂KN-93对各受体及PPI各相关蛋白的影响
2.11 抑制剂KN-93对类固醇激素合成通路的影响
3 讨论
4 小结
全文总结
参考文献
致谢
个人简介
导师简介
附件
本文编号：4035494
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【学位级别】：博士
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摘要
Summary
英文缩略表
第一章 综述
1.骆驼的生殖生理
1.1 骆驼的分类及分布
1.2 骆驼的生殖特性
1.3 骆驼生殖生理
2 视黄醇及其代谢过程
2.1 视黄醇与动物生殖
2.2 视黄醇结合蛋白RBP的研究进展
2.3 视黄醇结合蛋白的作用机理
2.4 视黄醇结合蛋白在生殖疾病方面的研究
3 钙离子及其代谢过程研究进展
3.1 钙离子的功能
3.2 钙离子与生殖
3.3 钙离子与钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ
3.4 钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ的生理功能
3.5 钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ与生殖相关疾病的关系
4 本实验的研究目的意义及创新点
第二章 双峰驼血清差异蛋白的筛选与鉴定
前言
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 试剂及仪器
1.3 方法
1.3.1 血清蛋白的提取
1.3.2 过滤辅助样品制备(FASP)消解
1.3.3 iTRAQ标记和SCX分馏
1.3.4 LC-MS/MS分析
1.3.5 数据分析
1.3.6 血清RNA的提取及qPCR反应
1.3.7 总蛋白的提取及蛋白免疫印迹
1.3.8 统计与分析
2 结果分析
2.1 双峰驼血清iTRAQ分析
2.2 鉴定差异表达蛋白
2.3 聚类分析和蛋白质间互作网络(PPI)分析
2.4 qPCR和 Western blot验证表达谱
3 讨论
4 小结
第三章 维生素A结合蛋白(RBP4)对AR的影响
前言
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
1.2.1 细胞原代培养
1.2.2 体外细胞处理和转染
1.2.3 实时荧光定量PCR
1.2.4 免疫组织化学染色
1.2.5 免疫荧光染色
1.2.6 统计分析
2 结果
2.1 RBP4 基因在双峰驼各组织的mRNA检测
2.2 RBP4在双峰驼性腺轴的检测
2.3 不同浓度VitA对其受体,结合蛋白(RBP4)及IGFs的影响
2.4 RBP4过表达载体的构建及其酶切鉴定
2.5 支持细胞转染过表达p-EGFP-RBP4 的效果检测
2.6 过表达RBP4对IGFs及类固醇激素合成的影响
2.7 siRNA-RBP4 的合成及沉默效率检测
2.8 沉默RBP4对IGFs及类固醇激素合成通路的影响
3 讨论
4 小结
第四章 双峰驼精清诱导排卵后卵巢差异蛋白质筛选
前言
1 材料和方法
1.1 试剂耗材
1.2 方法
1.2.1 动物和处理条件
1.2.2 精液收集和精清制备
1.2.3 精清注射及血清样品收集
1.2.4 样品的采集
1.2.5 qRT-PCR和 RT-PCR
1.2.6 蛋白质印迹
1.2.7 组织免疫荧光染色
1.2.8 数据分析
2 结果分析
2.1 卵泡直径和血清激素水平
2.2 蛋白质分析
2.3 差异表达蛋白的鉴定
2.4 蛋白质-蛋白质互作网络(PPI)分析
2.5 表达谱验证
2.6 组织表达分析
3 讨论
4 小结
第五章 CAMK2G通过类固醇通路调控ER的表达
前言
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
1.2.1 不同浓度抑制剂处理细胞
1.2.2 细胞转染及其它方法
2 结果
2.1 CAMK2G的表达分析
2.2 过表达载体p-EGFP-CAMK2G酶切验证
2.3 双峰驼颗粒细胞转染过表达p-EGFP-CAMK2G的效果检测
2.4 过表达CAMK2G对各受体的影响
2.5 过表达CAMK2G对类固醇激素合成通路的影响
2.6 siRNA-CAMK2G沉默效率的检测
2.7 敲低CAMK2G对各受体及PPI各相关蛋白的影响
2.8 敲低CAMK2G对类固醇激素合成通路的影响
2.9 抑制剂KN-93对CAMK2G的影响
2.10 抑制剂KN-93对各受体及PPI各相关蛋白的影响
2.11 抑制剂KN-93对类固醇激素合成通路的影响
3 讨论
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