miR-127靶向抑制ACO2基因表达及其通路研究

发布时间：2017-03-30 19:02

  本文关键词：miR-127靶向抑制ACO2基因表达及其通路研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：猪骨骼肌肌纤维类型和结构特征是影响猪肉品质的一个关键因素。本研究结合课题组前期高通量测序的结果和数据分析,以可能调控肌纤维类型的miR-127为研究对象,旨在阐述miR-127靶向基因及其调控通路。本试验以60头阉割杜×(长×大)猪(DLY)63d、98d和161d背最长肌为试验样品,通过制作石蜡切片和HE染色测定不同发育阶段其肌纤维类型比例。后又以1日龄DLY仔猪为试验对象,分离出原代猪骨骼肌卫星细胞,转染miR-127mimics/inhibitor,运用实时荧光定量PCR(SYBR Green I)方法测定骨骼肌卫星细胞中ACO2、SETD8、MEF2、MAPK1、MAPK3、MAPK4和MYH7等肌纤维发育相关基因表达量,同步采用Western blot的方法测定骨骼肌卫星细胞中MYH7蛋白的表达量。配制无赖氨酸的细胞培养基,培养骨骼肌卫星细胞24h后收集细胞,测定MEF2和MYH7基因表达量。最后通过构建载体,将正常序列ACO2-TargetN和突变序列ACO2-TargetM分别连接到含有萤光素酶报告基因的质粒,试验组与miR-127的mimics共转染进293A细胞,对照组与阴性对照NC共转染进293A细胞,结合萤光素酶活性检测来验证miR-127与ACO2之间的靶位关系。结果表明:1.随着猪日龄的增加,Ⅱa型红肌纤维所占比重逐步减少,63d龄所占比重显著高于98d和161d龄(P0.05),98d和161d龄之间所占比重差异不显著(P0.05);随着猪日龄的增加,Ⅱx+Ⅱb型白肌纤维所占比重逐步增多,63d龄所占比重显著低于98d和161d龄(P0.05),98d和161d龄之间所占比重差异不显著(P0.05)。2.骨骼肌卫星细胞转染miR-127的模拟物mimics之后,细胞中慢肌纤维MYH7基因和蛋白表达量显著下降(P0.05),ACO2、MEF2和MAPK3基因表达量显著下降(P0.05),对SETD8、MAPK4和MAPK1的基因表达无显著影响(P0.05);而转染miR-127的抑制剂inhibitor之后,细胞中慢肌纤维MYH7基因表达量无显著变化(P0.05)、但蛋白表达量显著上升(P0.05),ACO2和MEF2的基因表达显著上升(P0.05),对SETD8、MAPK4、MAPK3和MAPK1的基因表达无显著影响(P0.05)。3.无赖氨酸培养基培养骨骼肌卫星细胞试验中,在缺乏赖氨酸的条件下,骨骼肌卫星细胞中MEF2基因表达显著下降(P0.05),MYH7基因表达也表现出下降趋势,但差异不明显(P0.05)。4.miR-127的mimics能使pmirGLO-ACO2-TargetN质粒萤火虫荧光素酶活性降低38.3%(P0.05),而miR-127的mimics与pmirGLO-ACO2-TargetM共转染时对其萤火虫荧光素酶活性无显著影响(P0.05)。综上所述,miR-127通过靶向抑制ACO2基因表达,降低细胞内赖氨酸含量,进而抑制MEF2和MYH7基因表达,而MYH7又是慢肌纤维的特征性基因,因此miR-127参与了肌纤维类型的调控。
【关键词】：杜×(长×大)三元杂交猪 miR-127 肌纤维类型 骨骼肌卫星细胞 靶基因
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S828
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 英文缩略词表7-11
• 1 前言11-13
• 2 材料与方法13-32
• 2.1 主要仪器设备及耗材13
• 2.2 主要试剂13-15
• 2.3 肌纤维分型测定15-17
• 2.3.1 主要试剂配制15-16
• 2.3.2 切片样品处理16
• 2.3.3 切片制作步骤16-17
• 2.4 猪骨骼肌卫星细胞的分离、培养及鉴定17-19
• 2.4.1 猪骨骼肌卫星细胞的分离17-18
• 2.4.2 猪骨骼肌卫星细胞的传代18
• 2.4.4 猪骨骼肌卫星细胞的鉴定18-19
• 2.5 猪骨骼肌卫星细胞转染19
• 2.6 赖氨酸缺失培养基培养猪骨骼肌卫星细胞19
• 2.7 肌纤维发育相关基因表达测定19-23
• 2.7.1 引物设计及合成19-20
• 2.7.2 总RNA提取及纯化20-21
• 2.7.3 反转录及cDNA鉴定21-23
• 2.7.4 目的基因mRNA表达丰度检测23
• 2.8 Western blot23-26
• 2.9 ACO2-TargetN和ACO2-TargetM载体构建26-31
• 2.9.1 ACO2-TargetN正常序列的获取26-27
• 2.9.2 PCR扩增片段胶回收27
• 2.9.3 目的片段与T载体的连接与转化27-28
• 2.9.4 ACO2-TargetM载体构建28-29
• 2.9.5 目的片段与T载体的双酶切反应29
• 2.9.6 目的片段与线性化表达载体pmirGLO的连接29-30
• 2.9.7 pmirGLO-ACO2-Target重组质粒的提取30-31
• 2.10 miRNA与荧光素酶报告基因载体共转染 293A细胞31
• 2.11 荧光素酶检测31-32
• 2.12 数据处理与统计方法32
• 3 结果与分析32-42
• 3.1 不同阶段背最长肌肌纤维类型变化规律32-33
• 3.2 猪骨骼肌卫星细胞的分离、纯化及鉴定33-34
• 3.3 骨骼肌卫星细胞的增值曲线34-35
• 3.4 骨骼肌卫星细胞转染miR-127后对MYH7基因和蛋白表达的影响35-36
• 3.5 miR-127调控肌纤维类型途径的确定36-39
• 3.5.1 转染miR-127对肌纤维发育相关基因表达的影响37-38
• 3.5.2 赖氨酸缺失培养基MEF2和MYH7基因表达的影响38-39
• 3.7 pmirGLO-ACO2表达载体的构建39-40
• 3.8 miR-127靶向ACO2的验证40-42
• 4 讨论42-47
• 4.1 日龄对肌纤维类型的影响42-44
• 4.2 miRNAs对骨骼肌发育相关通路的影响44-45
• 4.3 miR-127靶向抑制ACO2基因及其作用通路45-47
• 5 结论47-48
• 致谢48-49
• 参考文献49-52

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

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本文编号：277816