稳定表达SHEV ORF3的HepG2细胞的转录组研究

发布时间：2017-04-11 06:03

  本文关键词：稳定表达SHEV ORF3的HepG2细胞的转录组研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus, HEV)导致的肝炎已经成为一个重要的世界性公共卫生问题,严重影响着人类的生活。SHEV是一种以猪作为宿主的HEV。ORF3蛋白作为一种调控蛋白,影响着靶细胞的多种信号通路。为了揭示SHEV ORF3对靶细胞的作用机理,本研究实验一根据SHEV ORF3基因序列,设计该基因的上下游引物,通过聚合酶链式反应从pET42a-ORF3质粒中克隆出基因ⅣV型MEVORF3基因,同时与绿色荧光表达载体pEGFP-N1进行双酶切,构建pEGFP-ORF3和pEGFP慢病毒载体,将慢病毒载体在HEK 293T细胞内包装成病毒颗粒,将病毒颗粒感染HepG2细胞,筛选单克隆细胞,使pEGFP-ORF3和pEGFP在HepG2细胞中稳定表达。运用流式细胞术和Western blotting进行鉴定,成功建立了HepG2-pEGFP-ORF3稳定表达细胞系。实验二提取HepG2-pEGFP-ORF3稳定细胞系的总RNA,应用RNA-seq对HepG2-pEGFP-ORF3细胞系进行测序,分析差异基因表达的情况,qRT-PCR对差异基因进行进一步验证,通过Gene Ontology对差异显著的基因进行分类。结果表明,在ORF3的稳定表达细胞系HepG2-pEGFP-ORF3中,HepG2细胞的CLDN6、YLPM1、 APOC3、NLRP1、SCARA3、FGA、FGG、FGB和FREM1基因的mRNA水平表达上调；而SLC2A3、DKK1、BPIFB2和PTGR1基因的mRNA水平下调。其中,CLDN6和FREM1基因的表达失调可能导致膜蛋白表达以及基底膜蛋白的完整性失调；NLRP1的表达失调可能会引起HepG2细胞的凋亡；PTGR1的表达失调可能会导致HepG2细胞凋亡。尤其值得注意的是,APOC3、SCARA3和DKK1的表达失调,可能影响到HepG2细胞的脂质代谢。本研究为进一步认识SHEV ORF3的功能提供了科学的线索,对揭示SHEV的致病机理及HE的治疗具有重要意义。
【关键词】：猪戊型肝炎病毒 开放阅读框3 人肝癌细胞 转录组测序
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第一章 综述9-19
• 1 HEV的研究进展9-15
• 1.1 HEV的研究概况9-10
• 1.2 HEV分子流行病学10
• 1.3 HEV基因类型及分布10-11
• 1.4 HEV的基因组结构11-13
• 1.5 HEV ORF3蛋白研究进展13-15
• 1.5.1 ORF3蛋白结构13
• 1.5.2 ORF3蛋白功能13-15
• 2 转录组测序的研究进展15-18
• 2.1 转录组测序15
• 2.2 转录组测序原理及应用15-18
• 2.2.1 转录组测序步骤15-16
• 2.2.2 转录组测序原理16
• 2.2.3 转录组测序应用16-18
• 3 研究目的及意义18-19
• 第二章 建立稳定表达SHEV ORF3基因的HepG2细胞系19-36
• 1 实验材料19-23
• 1.1 细胞和菌种19-20
• 1.2 主要试剂20-21
• 1.3 主要仪器21
• 1.4 主要溶液配制方法21-23
• 1.4.1 细胞培养以及常用溶液配制21-22
• 1.4.2 Western blotting常用溶液配制22-23
• 2 实验方法23-32
• 2.1 稳定细胞系的建立23-32
• 2.1.1 HepG2细胞的培养23-25
• 2.1.2 慢病毒载体的构建25-28
• 2.1.3 慢病毒包装28
• 2.1.4 慢病毒感染HepG2细胞28
• 2.1.5 稳定细胞系的筛选28-29
• 2.1.6 流式细胞术鉴定29
• 2.1.7 Western blotting鉴定29-32
• 3 结果与分析32-34
• 3.1 稳定细胞系的建立及鉴定32-34
• 3.1.1 慢病毒绿色荧光蛋白感染HepG2的效率观察32
• 3.1.2 单克隆细胞的鉴定32-33
• 3.1.3 Western blotting鉴定33-34
• 4 讨论34-36
• 第三章 稳定表达SHEV ORF3基因的HepG2细胞转录组测序及分析36-55
• 1 实验材料36-38
• 1.1 细胞36
• 1.2 主要试剂36-37
• 1.3 主要仪器37
• 1.4 主要溶液配制方法37-38
• 2 实验方法38-42
• 2.1 细胞培养与样本收集38
• 2.2 稳定细胞系总RNA的提取38
• 2.3 mRNA的建库和测序38-39
• 2.4 RNA-seq分析39-40
• 2.4.1 测序数据处理39-40
• 2.4.2 基因水平差异表达研究40
• 2.5 差异基因进行qRT-PCR验证40-42
• 2.5.1 总RNA的反转录40-41
• 2.5.2 qRT-PCR技术检测mRNA41-42
• 2.6 差异表达mRNA分析42
• 3 结果与分析42-53
• 3.1 测序数据预处理结果42-43
• 3.2 参考基因组比对43-45
• 3.2.1 测序数据与参考基因组比对的reads统计43-44
• 3.2.2 参考基因组比对区域以及密度分布44-45
• 3.3 基因表达水平分析45-47
• 3.3.1 基因表达值分布45-46
• 3.3.2 基因表达值密度46-47
• 3.4 差异基因表达水平分析47-52
• 3.4.1 差异基因表达水平火山图分析47-48
• 3.4.2 Venn图筛选共有差异表达基因48-49
• 3.4.3 共有差异表达基因热图49-52
• 3.5 qRT-PCR验证52
• 3.6 显著差异表达基因GO聚类分析52-53
• 4 讨论53-55
• 结论55-56
• 英文缩略对照表56-58
• 参考文献58-66
• 附录66-74
• 致谢74

【参考文献】

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