绵羊妊娠早期骨髓表达ISG15研究和PIBF的研究

发布时间：2017-04-11 07:04

  本文关键词：绵羊妊娠早期骨髓表达ISG15研究和PIBF的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：免疫器官由中枢免疫器官和周围免疫器官两部分组成,其中中枢免疫器官包括骨髓和胸腺。骨髓是T淋巴细胞的出生地,骨髓的重要功能就是生成各种细胞的干细胞,这些干细胞通过分化再生成各种血细胞如红细胞、白细胞、血小板等,因此,骨髓不但是造血器官,对于维持机体的生命和免疫力也非常重要。为探索绵羊妊娠早期对中枢免疫器官骨髓的影响,本试验以繁殖机能正常的绵羊为试验动物,研究妊娠早期绵羊骨髓表达ISG15和PIBF因子的的变化规律。首先对绵羊埋植孕激素海绵栓,进行同期发情处理,进而试情并配种(对照组不配种)。然后采集发情后第16天未配种的,以及配种后第13、16和25天妊娠的绵羊骨髓(通过屠宰解剖,确定配种后第13、16和25天妊娠的绵羊,即看到孕体的存在)。将不同妊娠天数的骨髓分别置于2mL冷冻管中保存在-196℃液氮中,带回实验室检测mRNA的表达和蛋白印迹分析。另外采集不同妊娠天数的绵羊骨髓,用PBS液冲洗后将骨髓块放入4%多聚甲醛的PBS溶液中固定,用于免疫组织化学检测。得到了如下结果:1、利用实时荧光定量PCR法检测和蛋白印迹分析发现,妊娠早期绵羊骨髓中的ISG15 mRNA和蛋白的表达量从未妊娠到妊娠期逐渐升高,ISG15 mRNA和蛋白在妊娠16天羊骨髓中的表达量高于未妊娠16天,妊娠13天和妊娠25天。而且在妊娠16天表达量达最高。然后,到妊娠25天表达量则会逐渐降低。通过免疫组织化学检测确认,ISG15蛋白在妊娠16天羊骨髓中的染色强度高于未妊娠16天,妊娠13天和妊娠25天,而且主要在骨髓间质的细胞质表达。总之,绵羊妊娠早期ISG15 mRNA和蛋白表达量的增加与孕体来源的干扰素tau有关。2、mRNA和蛋白水平进行了PIBF因子表达的检测,证明在妊娠16天羊骨髓中mRNA的表达量高于未妊娠16天,妊娠13天和妊娠25天。而且在妊娠16天表达量达最高。然而,到妊娠25天mRNA表达量则会逐渐降低,蛋白水平的表达与mRNA水平的表达基本一致,在妊娠13天、妊娠16天和妊娠25天羊骨髓中的表达,在未妊娠16天的骨髓中不表达。妊娠16天和25天骨髓PIBF蛋白的表达量显著高于妊娠13天,妊娠16天和妊娠25天的骨髓中PIBF蛋白的表达明显,基本没有差异。总之,在绵羊妊娠早期,孕体来源的干扰素tau通过血液循环,作用于骨髓,使骨髓间质的细胞上调表达ISG15 mRNA和蛋白;同时结果表明,妊娠早期PIBF也上调表达,可能是干扰素tau通过血液循环抑制黄体的退化,使黄体持续产生孕酮,从而诱导PIBF蛋白上调表达,调节骨髓的免疫功能,使绵羊胚胎免受母体免疫系统的排除,有利于妊娠的继续。
【关键词】：妊娠 骨髓 干扰素刺激基因15 KDa蛋白 孕酮诱导阻断因子
【学位授予单位】：河北工程大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S826
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 英文缩略表12-13
• 第一章 文献综述13-23
• 1.1 引言13-14
• 1.2 妊娠早期的胚胎识别14-20
• 1.2.1 胚胎妊娠识别14-15
• 1.2.2 妊娠识别的分子调控机制15
• 1.2.3 反刍动物妊娠识别信号--IFN-τ15
• 1.2.4 反刍动物IFN-τ 的产生15-17
• 1.2.5 IFN-τ 的子宫内作用17-19
• 1.2.6 IFN-τ 的子宫外作用19
• 1.2.7 IFN-τ 诱导产生ISG1519-20
• 1.2.8 IFN-τ 的抗黄体溶解机制20
• 1.3 免疫耐受机制的研究进展20-22
• 1.3.1 孕酮在早期妊娠对机体的免疫耐受作用20-21
• 1.3.2 孕酮诱导阻断因子介导的妊娠免疫耐受作用21
• 1.3.3 PIBF通过干扰素信号通路参与子宫内的免疫调节21
• 1.3.4 孕酮介导其它调节基因参与免疫21-22
• 1.4 本研究的技术路线和目的、意义22-23
• 1.4.1 本研究技术路线22
• 1.4.2 研究目的与意义22-23
• 第二章 ISG15在绵羊骨髓中的表达23-40
• 2.1 试验材料与方法23-24
• 2.1.1 试验动物23
• 2.1.2 主要仪器和设备23
• 2.1.3 主要试剂和耗材23-24
• 2.2 试验方法24-25
• 2.3 样品采集与处理25-26
• 2.4 实时荧光定量PCR检测基因相对表达水平26-28
• 2.4.1 实时荧光定量PCR的引物序列26-27
• 2.4.2 总RNA的提取和RNA浓度及纯度检测27
• 2.4.3 cDNA的合成27-28
• 2.4.4 实时荧光定量PCR28
• 2.4.5 PCR产物凝胶电泳28
• 2.5 免疫组织化学染色28-30
• 2.5.1 免疫组织化学染色溶液配制：28-29
• 2.5.2 免疫组织化学染色方法29-30
• 2.6 蛋白免疫印迹分析30-34
• 2.6.1 Western-Blot所用溶液配制30-32
• 2.6.2 ISG15一抗的制备32-33
• 2.6.3 提取骨髓总蛋白33
• 2.6.4 蛋白定量33
• 2.6.5 SDS-PAGE电泳33-34
• 2.7 数据分析34
• 2.8 结果与分析34-38
• 2.8.1 总RNA提取与PCR扩增电泳34-35
• 2.8.2 实时荧光定量PCR目的片段扩增产物鉴定35
• 2.8.3 实时荧光定量PCR结果35-36
• 2.8.4 免疫组织化学结果36-37
• 2.8.5 蛋白免疫印迹分析结果37-38
• 2.9 讨论38-40
• 第三章 PIBF在绵羊骨髓中的表达40-46
• 3.1 试验材料与方法40
• 3.1.1 试验动物40
• 3.1.2 主要仪器和设备40
• 3.1.3 主要试剂和药品40
• 3.2 试验方法与步骤40
• 3.3 样品采集与处理40
• 3.4 实时荧光定量PCR检测基因相对表达水平40-41
• 3.4.1 实时荧光定量PCR的引物序列40-41
• 3.4.2 总RNA的提取和RNA浓度及纯度检测41
• 3.4.3 cDNA的合成41
• 3.4.4 实时荧光定量PCR41
• 3.4.5 PCR产物凝胶电泳41
• 3.5 蛋白免疫印迹分析41-42
• 3.5.1 Western-Blot所用溶液配制：41
• 3.5.2 Trizol法提取骨髓总蛋白41
• 3.5.3 蛋白定量（BCA）41-42
• 3.5.4 SDS-PAGE电泳42
• 3.6 数据分析42
• 3.7 结果与分析42-44
• 3.7.1 总RNA提取与PCR扩增电泳42
• 3.7.2 实时荧光定量PCR目的片段扩增产物鉴定42
• 3.7.3 实时荧光定量PCR结果42-43
• 3.7.4 蛋白免疫印迹分析结果43-44
• 3.8 讨论44-46
• 第四章 全文总结46-47
• 4.1 本研究的主要结论和创新46
• 4.2 下一步研究计划46-47
• 致谢47-48
• 参考文献48-55
• 作者简介55
• 攻读硕士学位期间的成果55-56

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 王泳翔;杨凌;毕江华;李树静;;孕酮在反刍动物早期妊娠中的免疫耐受作用[J];中国畜牧兽医;2015年02期

2 程蕾;王定发;刘晓华;向敏;凌明湖;胡修忠;夏瑜;;ISG15和OAS1在奶牛早期妊娠阶段外周血中的表达规律[J];畜牧兽医学报;2015年01期

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4 王惠;钱冲;郭峰;关超;苏长青;白洪志;;实时定量PCR检测技术研究进展[J];种子;2013年06期

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1 姚佳;孕酮与干扰素-τ对体外培养的牛子宫内膜细胞基因组表达谱的影响[D];四川农业大学;2011年

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本文编号：298549