流行性乙型脑炎RT-RPA-LFD检测方法的建立与评价

发布时间：2017-04-13 02:25

  本文关键词：流行性乙型脑炎RT-RPA-LFD检测方法的建立与评价，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)是我国法定乙类传染病,属于人畜共患传染病,主要引起病毒性脑炎和繁殖障碍,对人类和动物的健康构成了严重的威胁,也给畜牧业带来了严重的经济损失。传统的检测方法大都存在特异性和敏感性差、操作繁琐、费时费力等缺点,不能满足兽医临床现地检测的需要。为了更好地诊断和监测该病,迫切需要建立一种快速、简便、准确的检测方法。近年来,核酸等温扩增技术发展迅速,它摆脱了传统的温度循环仪,可以在短时间内迅速进行扩增反应。重组酶聚合酶等温扩增技术(Recombinase Ploymerase Amplication,RPA)是一种新型核酸等温扩增技术,模拟生物体内DNA复制过程,在37℃—42℃即可对目标片段进行等温扩增,并在20 min完成扩增反应,具有反应迅速、操作简便等技术优点,同时还具有高度特异和敏感的特点。本研究通过将重组酶聚合酶等温扩增技术与封闭式侧向流层析技术(LFD)结合,使JEV病原检测更加易于判定,在基层临床快速检测中具有广泛的应用前景。本研究主要是建立了一种RT RPA LFD的快速检测方法,并对其敏感性、特异性以及临床应用的可行性进行评价,其研究内容与结果如下:1.建立了乙型脑炎RT-RPA-LFD检测方法:本研究通过12株不同JEV基因的对比,选择E基因的保守区域设计RPA上、下游引物数对,结合2%琼脂糖凝胶体系筛选出最优引物,并扩增出293 bp的目的片段,形成RT-RPA琼脂糖凝胶检测体系。在最优引物之间,设计RPA nfo长探针(46 bp),并对上游引物和探针进行标记,在RPA nfo反应体系中加入探针,结合封闭式侧向流层析技术,建立RT RPA LFD检测体系。以纯水、细胞、猪脑组织液、蚊子组织液作为阴性对照,进行RT RPA LFD反应试纸条均呈现阴性,验证了RT RPA LFD方法的成立。以经典株JEV/sw/GD/2009株、P3株、SA14 14 2株分别进行RT RPA LFD反应均呈现阳性,证明RT RPA LFD可适用于多种毒株的检测。试验证明,RT RPA LFD检测方法可以用于多种JEV分离株的检测,方便携带,适用性强,20 25 min即可获得稳定、准确的检测结果。2.对已建立的JEV RT RPA LFD检测方法的特异性、敏感性以及临床应用的可行性进行评价:本研究以猪临床常见的7种致病病原作为特异性对照,进行JEV RT RPA LFD反应试纸条均呈现阴性,证明RT RPA LFD检测方法的特异性强。用JEV RT RPA LFD检测方法与常规RT PCR反应进行对比,可以检测到的c DNA最低检测限达100 fg、标准重组质粒的最低检测限达103拷贝/μL、JEV/sw/GD/2009株TCID50/m L最低检测限达104.5,二种检测方法均保持一致,说明RT RPA LFD检测方法具有较高的敏感性。以猪脑组织液、蚊子组织液作为稀释液模拟临床试验,在猪脑模拟临床试验中,可检测到的JEV TCID50/m L最低检测限达103.5,在蚊子模拟临床试验中,可检测到的JEV TCID50/m L最低检测限达104.5,本试验证明了RT RPA LFD检测方法在临床应用上的可行性。总结:本论文建立了JEV RT RPA LFD的快速检测方法,具有耗时短、操作简便、结果判定准确直观的优点,更适合用于JEV现地检测和在基层推广应用。
【关键词】：RPA 封闭式侧向流层析技术 JEV 临床检测
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S855.3
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 1 引言11-21
• 1.1 JEV病原学特征11-13
• 1.1.1 JEV分子生物学特征11-13
• 1.1.2 JEV培养特性13
• 1.2 乙型脑炎流行病学特征13-14
• 1.3 乙型脑炎诊断方法研究进展14-20
• 1.3.1 临床症状14
• 1.3.2 病毒的分离鉴定14
• 1.3.3 血清学诊断14-16
• 1.3.4 分子生物学诊断16-17
• 1.3.5 重组酶聚合酶等温扩增技术17-20
• 1.4 全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置20-21
• 1.5 研究目的与意义21
• 2 材料与方法21-33
• 2.1 材料21-22
• 2.1.1 毒株21-22
• 2.1.2 样品来源22
• 2.1.3 细胞、菌种及克隆载体22
• 2.1.4 主要试剂22
• 2.1.5 主要实验仪器22
• 2.2 方法22-33
• 2.2.1 病毒DNA/RNA抽提22-23
• 2.2.2 cDNA合成23-24
• 2.2.3 常规PCR检测引物及反应体系24-25
• 2.2.4 JEV E基因质粒标准品的制备25-28
• 2.2.5 RT-RPA凝胶反应体系的建立28-29
• 2.2.6 RT-RPA LFD反应体系的建立29-32
• 2.2.7 JEVRT-RPA-LFD检测方法应用于JEV不同分离株的检测32
• 2.2.8 JEV RT-RPA LFD方法特异性分析32
• 2.2.9 JEV RT-RPA-LFD方法敏感性分析32
• 2.2.10 JEV临床模拟试验32-33
• 3 结果与分析33-43
• 3.1 RT-RPA凝胶反应体系的建立及引物筛选33-35
• 3.2 JEV RT-RPA-LFD方法的建立35
• 3.3 不同JEV毒株RT-RPA-LFD的敏感性分析35-36
• 3.4 JEV RT-RPA-LFD方法特异性分析36-37
• 3.5 JEV RT-RPA-LFD检测方法的敏感性分析37-40
• 3.5.1 JEV RT-RPA-LFD的cDNA敏感性分析37-38
• 3.5.2 JEV RT-RPA-LFD的重组质粒拷贝数敏感性分析38-39
• 3.5.3 JEV RT-RPA-LFD的毒株浓度敏感性分析39-40
• 3.6 JEV RT-RPA-LFD临床模拟试验40-43
• 3.6.1 猪脑模型JEV RT-RPA-LFD方法的临床模拟试验40-41
• 3.6.2 蚊子模型JEV RT-RPA-LFD方法的临床模拟试验41-43
• 4 讨论43-46
• 全文总结46-47
• 致谢47-49
• 参考文献49-54

【参考文献】

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本文编号：302615