表达空肠弯曲菌保护性抗原cfrA、cjaA基因的重组乳酸菌的构建及口服免疫研究

发布时间：2017-04-13 19:04

  本文关键词：表达空肠弯曲菌保护性抗原cfrA、cjaA基因的重组乳酸菌的构建及口服免疫研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是弯曲菌属的一种微需氧革兰氏阴性菌,可在宿主肠道中定殖和感染引起多种疾病,如感染人引起肠炎和腹泻,是人最重要的食源性病原菌之一。控制家禽弯曲菌的污染是降低人感染该菌最直接有效的手段,本研究拟结合特异性与非特异性免疫,将空肠弯曲菌保护性抗原基因导入食品级乳酸菌表达系统,构建表达保护性抗原的重组乳酸菌口服免疫制剂,达到降低鸡肠道空肠弯曲菌定殖水平的目的。本研究首先将空肠弯曲菌肠菌素受体蛋白CfrA编码基因导入食品级乳酸乳球菌表达系统,将构建的重组乳酸乳球菌口服免疫鸡,达到降低空肠弯曲菌在鸡肠道中定殖的目的。利用PCR分别扩增空肠弯曲菌CfrA全基因及其N端片段,插入食品级表达载体p NZ8149多克隆位点并转化乳酸乳球菌NZ3900,通过Western blot鉴定重组菌株CfrA蛋白表达情况,筛选nisin浓度、温度、时间等诱导条件优化重组蛋白表达水平;将重组乳酸乳球菌经口服免疫SPF鸡,免疫后分别测定乳酸乳球菌自鸡体内的排出情况、诱导CfrA血清抗体和粘膜抗体水平,最后将空肠弯曲菌口服攻毒免疫后的鸡,测定鸡泄殖腔棉拭子中空肠弯曲菌的数目来判定口服免疫效果。Western blot检测显示CfrA全基因及其N端片段均可在重组乳酸乳球菌胞内可溶性表达,不能分泌至胞外,筛选的最佳诱导表达条件为nisin浓度25 ng/m L、温度37℃、时间1 h。口服乳酸乳球菌10 d内自鸡体完全排空;鸡口服免疫后可产生CfrA蛋白特异性的血清IgG和肠粘膜sIgA抗体;重组乳酸乳球菌口服免疫后空肠弯曲菌在鸡体内的增殖速度显著低于对照组。本研究成功构建了重组CfrA蛋白的食品级乳酸乳球菌诱导表达系统;表达CfrA蛋白的重组乳酸乳球菌口服免疫鸡对空肠弯曲菌在鸡肠道的定殖具有一定的抑制作用。在空肠弯曲菌CfrA蛋白重组表达的基础上,构建CjaA及CjaA-LTB蛋白重组乳酸乳球菌分泌性表达系统。利用PCR扩增乳酸乳球菌-MG1363-未知分泌蛋白Usp45基因分泌信号肽的编码序列SPusp45,克隆到食品级载体p NZ8149中,以空肠弯曲菌主要免疫保护性抗原CjaA蛋白的基因片段为靶基因,并插入大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因(LTB),构建了表达空肠弯曲菌cjaA基因和融合表达cjaA-LTB的重组分泌性乳酸乳球菌表达系统,并对免疫效果进行比较分析,Western blot检测显示cjaA基因可在重组乳酸乳球菌胞内可溶性表达,口服乳酸乳球菌7 d内自鸡体慢慢排空;鸡口服免疫后可产生CjaA蛋白特异性的血清IgG和肠粘膜sIgA抗体;重组乳酸乳球菌口服免疫后空肠弯曲菌在鸡体内的增殖速度显著低于对照组。结果成功构建了重组CjaA蛋白的食品级分泌性乳酸乳球菌诱导表达系统;表达CjaA蛋白的重组乳酸乳球菌口服免疫鸡对空肠弯曲菌在鸡肠道的定殖具有一定的抑制作用。本研究成功构建了表达空肠弯曲菌保护性抗原的食品级乳酸乳球菌表达系统,口服免疫鸡可显著降低空肠弯曲菌的定殖能力,为研制重组乳酸菌口服家禽免疫制剂防治空肠弯曲菌奠定了坚实的基础。
【关键词】：空肠弯曲菌 乳酸乳球菌 肠菌素受体CfrA 膜转运蛋白CjaA 表达 口服免疫
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 中文摘要11-13
• Abstract13-15
• 1. 引言15-28
• 1.1 空肠弯曲菌研究现状15-21
• 1.1.1 病原学15-16
• 1.1.2 流行病学16-18
• 1.1.3 毒力因子18-19
• 1.1.4 检测空肠弯曲菌的方法19-21
• 1.2 乳酸菌及其表达系统的研究现状21-25
• 1.2.1 乳酸菌的概述21-22
• 1.2.2 乳酸菌表达系统22-23
• 1.2.3 食品级表达系统23-25
• 1.2.4 乳酸菌作为活疫苗抗原传递载体25
• 1.3 黏膜免疫的研究进展25-27
• 1.3.1 黏膜免疫疫苗的研究25-26
• 1.3.2 大肠杆菌不耐热毒素(LT)作为黏膜免疫佐剂的研究26-27
• 1.4 本研究的目的与意义27-28
• 2. 材料与方法28-53
• 2.1 材料28-31
• 2.1.1 菌种28
• 2.1.2 主要试剂与试剂盒28
• 2.1.3 主要仪器28
• 2.1.4 主要溶液及培养基的制备28-31
• 2.2 胞内表达空肠弯曲菌cfrA基因重组乳酸乳球菌的构建31-39
• 2.2.1 空肠弯曲菌cfrA基因重组乳酸乳球菌表达载体的构建技术路线图(见图 2-1)31-32
• 2.2.2 乳酸乳球菌表达质粒pNZ8149质粒图谱32
• 2.2.3 cfrA基因的PCR扩增32-34
• 2.2.4 cfrA基因的克隆与鉴定34-37
• 2.2.5 表达cfrA基因重组乳酸乳球菌的构建37-39
• 2.3 cfrA基因在重组乳酸乳球菌中的表达及表达条件的优化39-41
• 2.3.1 重组乳酸乳球菌cfrA基因的诱导表达39
• 2.3.2 表达产物的Western blot检测分析39-40
• 2.3.3 重组乳酸乳球菌表达条件的优化40-41
• 2.4 表达CfrA蛋白的重组乳酸乳球菌口服免疫研究41-42
• 2.4.1 口服免疫41
• 2.4.2 乳酸乳球菌自鸡体内排出的测定41
• 2.4.3 血清IgG和肠粘膜sIgA的测定41-42
• 2.4.4 攻毒保护试验42
• 2.5 表达空肠弯曲菌cjaA基因大肠杆菌重组表达载体的构建42-45
• 2.5.1 cjaA基因的PCR扩增42-43
• 2.5.2 cjaA基因的克隆与鉴定43-44
• 2.5.3 表达cjaA基因重组大肠杆菌的构建44-45
• 2.6 cjaA基因在重组大肠杆菌中的表达与纯化45-46
• 2.6.1 重组蛋白的诱导表达45
• 2.6.2 重组蛋白的纯化45-46
• 2.7 分泌表达空肠弯曲菌cjaA与cjaA-ltb基因的重组乳酸乳球菌的构建46-50
• 2.7.1 表达cjaA与cjaA-ltb基因重组分泌性乳酸乳球菌的构建示意图46-47
• 2.7.2 cjaA、SPusp45和ltb基因的PCR扩增47-48
• 2.7.3 cjaA、SPusp45和ltb基因的克隆与鉴定48
• 2.7.4 分泌性重组表达载体的构建48-49
• 2.7.5 表达cjaA基因重组分泌性乳酸菌表达系统的构建49-50
• 2.7.6 融合表达cjaA与ltb重组分泌性乳酸菌表达系统的构建50
• 2.8 cjaA与cjaA-ltb基因在重组分泌性乳酸乳球菌中的表达50-51
• 2.8.1 重组乳酸乳球菌的诱导表达50
• 2.8.2 表达产物的Western blot检测分析50-51
• 2.9 表达CjaA蛋白和融合表达CjaA与LTB重组分泌性乳酸乳球菌口服免疫研究51-53
• 2.9.1 口服免疫51
• 2.9.2 乳酸乳球菌自鸡体内排出的测定51-52
• 2.9.3 血清IgG和肠粘膜sIgA的测定52
• 2.9.4 攻毒保护试验52-53
• 3. 结果与分析53-68
• 3.1 胞内表达空肠弯曲菌cfrA基因重组乳酸乳球菌的构建53-55
• 3.1.1 cfrA基因的PCR扩增53
• 3.1.2 cfrA基因的克隆与鉴定53-54
• 3.1.3 表达cfrA基因重组乳酸乳球菌的构建54-55
• 3.2 cfrA基因在重组乳酸乳球菌中的表达及表达条件的优化55-58
• 3.2.1 表达产物的Western blot检测分析55-56
• 3.2.2 重组乳酸乳球菌表达条件的优化56-58
• 3.3 表达CfrA蛋白的重组乳酸乳球菌口服免疫研究58-60
• 3.3.1 重组乳酸乳球菌自鸡体内排出的测定结果58
• 3.3.2 血清IgG和肠粘膜sIgA抗体水平的测定结果58-59
• 3.3.3 空肠弯曲菌在鸡肠道内定殖的测定结果59-60
• 3.4 表达空肠弯曲菌cjaA基因大肠杆菌重组表达载体的构建60-61
• 3.4.1 cjaA基因的PCR扩增60
• 3.4.2 cjaA基因的克隆与鉴定60
• 3.4.3 大肠杆菌重组表达载体的构建60-61
• 3.5 cjaA基因在重组大肠杆菌中的表达与纯化61-62
• 3.6 分泌表达空肠弯曲菌cjaA与cjaA-ltb基因重组乳酸乳球菌的构建62-63
• 3.6.1 SPusp45、cjaA和ltb基因的PCR扩增62
• 3.6.2 SPusp45、cjaA和ltb基因的克隆与鉴定62-63
• 3.6.3 分泌性重组表达载体的构建63
• 3.7 cjaA与cjaA-ltb基因在重组分泌性乳酸乳球菌中的表达63-66
• 3.7.1 表达产物的SDS-PAGE检测分析63-64
• 3.7.2 表达产物的Western blot检测分析64-65
• 3.7.3 分泌表达的Western blot检测分析65-66
• 3.8 表达CjaA蛋白的重组分泌性乳酸乳球菌口服免疫研究66-68
• 3.8.1 重组乳酸乳球菌自鸡体内排出的测定结果66
• 3.8.2 口服免疫后鸡体重的变化66-67
• 3.8.3 血清IgG和肠粘膜sIgA抗体水平的测定结果67-68
• 3.8.4 空肠弯曲菌在鸡肠道内定殖的测定结果68
• 4. 讨论68-72
• 5. 结论72-73
• 参考文献73-78
• 致谢78-79
• 个人简介79-80
• 攻读硕士学位期间发表的论文80

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

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  本文关键词：表达空肠弯曲菌保护性抗原cfrA、cjaA基因的重组乳酸菌的构建及口服免疫研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：304252