MiR-15a/b通过抑制FoxO1促进猪前体脂肪细胞分化

发布时间：2025-05-05 02:30

　　MiRNA是长度为19-23nt的非编码RNA序列，可通过与靶基因mRNA的3'UTR结合使其降解或抑制其翻译。目前已有报道称miRNA在细胞凋亡，癌症发育，炎症反应以及细胞增殖与分化中均有重要作用。MiR-15a/b家族庞大（多于十个成员），种子区域保守性好，在许多生理活动中均有重要作用。为探明miR-15a/b对猪前体脂肪细胞发育的影响，通过实验检测了miR-15a/b在猪前体脂肪细胞中的表达图谱，并构建了miR-15a/b前体序列的腺病毒载体，用载体侵染原代细胞观察miR-15a/b的超表达对脂肪细胞分化的影响。之后筛选miR-15a/b的靶基因并通过双萤光素酶报告分析的方法鉴定靶基因的准确性，主要研究结果如下： 1.检测miR-15a/b在脂肪组织中的表达谱，发现miR-15a/b在脂肪分化前4天表达量较高，随后表达量呈下降趋势，表明miR-15a/b可能在脂肪分化的初期起作用； 2.构建miR-15a/b腺病毒超表达载体，经过质粒构建、包装、扩繁和毒力测定后，高浓度的miR-15a/b腺病毒侵染猪原代脂肪细胞后，miR-15a表达量增加了2倍，miR-15b的表达量增加...

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【学位级别】：硕士

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摘要
ABSTRACT
第一部分 文献综述
    第一章 MiRNA 文献综述
        1.1 MiRNA 的发现历史
        1.2 MiRNA 的生物合成，预测鉴定及靶基因筛选
            1.2.1 MiRNA 的生物合成
            1.2.2 MiRNA 的预测及鉴定
            1.2.3 MiRNA 靶基因的筛选
        1.3 MiRNA 在各领域的研究进展
            1.3.1 MiRNA 对增殖分化（prolifeciation & differentation）的影响
            1.3.2 MiRNA 在免疫（immunization）调节中的作用
            1.3.3 MiRNA 在癌症（cancer）及凋亡（apoptosis）过程中的作用
            1.3.4 MiRNA 在代谢（metabolism）调节中的作用
        1.4 MiRNA 研究展望
    第二章 MiR-15a/b 研究进展
        2.1 MiR-15a/b 家族简介及其结构
        2.2 MiR-15a/b 的研究进展
        2.3 MiR-15a/b 与代谢相关的研究进展
    第三章 FoxO1 研究进展
        3.1 FoxO1 的简介
        3.2 FoxO1 对脂肪分化的影响
第二部分 实验研究
    第四章 MiR-15a/b 的保守性分析及表达谱的确定
        4.1 实验材料
            4.1.1 实验动物
            4.1.2 实验试剂
        4.2 试验方法
            4.2.1 数据库检索 miR-15a/b 保守型
            4.2.2 猪原代脂肪细胞的分离培养
            4.2.3 猪原代脂肪细胞的诱导分化
            4.2.4 总 RNA 的提取
            4.2.5 RNA 的反转录
            4.2.6 实时定量
            4.2.7 数据分析
        4.3 结果与分析
            4.3.1 生物信息学分析结果
            4.3.2 MiR-15a/b 在猪原代脂肪细胞成脂分化过程中的表达谱
        4.4 讨论
    第五章 腺病毒构建及侵染效果
        5.1 实验材料
            5.1.1 质粒、菌株及细胞株
            5.1.2 工具酶和其它试剂
        5.2 实验方法
            5.2.1 设计 miR-15a/b 扩增引物
            5.2.2 组织总 RNA 提取
            5.2.3 RNA 反转录 cDNA
            5.2.4 cDNA 扩增 Pri-miR-15a/b 基因
            5.2.5 DNA 片段的回收
            5.2.6 DH5α感受态细胞的制备
            5.2.7 质粒转化 DH5α感受态细胞
            5.2.8 质粒的小量提取
            5.2.9 穿梭质粒 pAdTrack-CMV-Pri-miR-15a/b 载体的构建
            5.2.10 重组质粒 pAd-Pri-miR-15a/b 的构建
            5.2.11 pAd-Pri-miR-15a/b 的扩繁、大量提取、线性化及纯化
            5.2.12 腺病毒包装、扩繁、纯化及毒力检测
        5.3 结果与分析
            5.3.1 Pri-miR-15a/b 扩增结果
            5.3.2 T 载体连接结果
            5.3.3 穿梭质粒鉴定结果
            5.3.4 重组质粒鉴定结果
            5.3.5 腺病毒包装结果
            5.3.6 腺病毒 pAd-miR-15a/b 的扩繁
            5.3.7 腺病毒 pAd-miR-15a/b 的毒力测定
        5.4 讨论
    第六章 腺病毒 pAd-miR-15a/b 侵染猪原代脂肪细胞
        6.1 实验材料
            6.1.1 实验动物及细胞
            6.1.2 实验试剂
        6.2 试验方法
            6.2.1 猪原代脂肪细胞分离步骤
            6.2.2 腺病毒侵染猪原代脂肪细胞及其诱导分化
            6.2.3 猪前体脂肪细胞分化过程中成脂相关基因的 mRNA 及蛋白的检测
            6.2.4 油红 O 检测细胞内脂滴含量
            6.2.5 数据分析
        6.3 结果与分析
            6.3.1 腺病毒侵染效果及 miR-15a/b 超表达
            6.3.2 油红 O 染色结果
            6.3.3 实时定量及 WB 实验结果
        6.4 讨论
    第七章 MiR-15a/b 靶基因的筛选及潜在靶基因表达量的检测
        7.1 实验材料
        7.2 实验方法
            7.2.1 生物信息学分析筛选靶基因
            7.2.2 检测候选靶基因的 mRNA 表达水平
            7.2.3 检测候选靶基因的蛋白表达水平
            7.2.4 数据分析
        7.3 结果与分析
            7.3.1 靶基因筛选结果
            7.3.2 候选靶基因 mRNA 表达量的检测
        7.4 讨论
    第八章 双萤光素酶报告分析鉴定 miR-15a/b 靶基因
        8.1 实验材料
        8.2 试验方法
            8.2.1 双萤光素酶载体 psiCHECK-2-IRS1 的构建
            8.2.2 双萤光素酶载体 psiCHECK-2- FoxO1 的构建
            8.2.3 双萤光素酶突变载体 psiCHECK-2-FoxO1-M 的构建
            8.2.4 双荧光素酶检测
        8.3 结果与分析
            8.3.1 载体 psiCHECK-2-IRS1 的构建及双萤光素酶检测结果
            8.3.2 载体 psiCHECK-2-FoxO1 和 psiCHECK-2-FoxO1-M 的构建及双萤光素酶检测结果
        8.4 讨论
结论
创新点
进一步研究内容
参考文献
致谢
作者简介



本文编号：4042983