C型产气荚膜梭菌α毒素蛋白的表达及其特异性IgY抗体的制备

发布时间：2025-05-08 01:00

　　C型产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens Type C）可感染猪、马、牛、羊等各种家畜，3日龄内新生仔猪最易感，俗称仔猪红痢，病死率高，严重威胁我国的家畜养殖业发展。C型产气荚膜梭菌主要产生α、β1和β2三种毒素，其中α毒素具有细胞毒性、溶血性、致死性和皮肤坏死性等特性，是C型产气荚膜梭菌一种重要的毒力因子。目前对于C型产气荚膜梭菌引起的红痢的防治，主要采取的措施是给怀孕母猪于产前肌肉注射C型产气荚膜梭菌疫苗，仔猪出生后喂食初乳，从而获得被动免疫保护，同时与青霉素、土霉素等抗生素类药物联合使用，以达到治疗的效果。临床上对于抗体类药物的使用较少，因为一般的抗体类药物成本较高。近年来，卵黄抗体（IgY）通过口服等途径来被动保护哺乳动物疾病的研究增加，由于禽类与哺乳动物物种距离较远，对哺乳动物高保守蛋白具有强反应性，且IgY产量高，经济成本较低，制备简单，因此在预防和治疗哺乳动物消化道等疾病方面具有明显的经济优势和广阔的市场空间。本实验对C型产气荚膜梭菌α毒素蛋白进行原核表达，生产抗α毒素的特异性IgY抗体，为以后临床低成本抗体药物的研制奠定基础。研究内容分为以下3个部...

【文章页数】：54 页

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摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 产气荚膜梭菌的生物学特点
        1.1.1 产气荚膜梭菌菌体形态特征
        1.1.2 产气荚膜梭菌菌体培养特征
        1.1.3 产气荚膜梭菌菌体的生化特征及抵抗力
    1.2 C 型产气荚膜梭菌的毒力因子
        1.2.1 α毒素（CPA）
        1.2.2 β1 毒素（CPB1）
        1.2.3 β2 毒素（CPB2）和β2 毒素编码基因（cpb2）
    1.3 C 型产气荚膜梭菌的致病机理
        1.3.1 α毒素（CPA）的致病机理
        1.3.2 β1 毒素（CPB1）的致病机理和作用部位
    1.4 IgY 技术在畜禽胃肠道疾病中的应用
        1.4.1 IgY 用于防治幼畜细菌性和病毒性腹泻
        1.4.2 IgY 用于防治禽细菌性和病毒性疾病
    1.5 本研究的目的及意义
第二章 C 型产气荚膜梭菌α毒素蛋白原核表达和纯化
    2.1 材料
        2.1.1 菌株与载体
        2.1.2 工具酶和试剂
        2.1.3 主要仪器
        2.1.4 所用溶液及培养基的配制
    2.2 方法
        2.2.1 C 型产气荚膜梭菌基因组的提取
        2.2.2 引物设计与合成
        2.2.3 α毒素基因的 PCR 扩增
        2.2.4 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳
        2.2.5 重组 T-Vector pMD19-α的克隆
        2.2.6 重组 T-Vector pMD19-α的鉴定
        2.2.7 重组表达质粒 pET-32a-α的构建与鉴定
        2.2.8 pET-32a-α的 BL 21（DE3）表达菌的构建
        2.2.9 表达蛋白的 Western blot 分析
        2.2.10 包涵体蛋白的纯化
        2.2.11 包涵体蛋白的复性
    2.3 结果与分析
        2.3.1 C 型产气荚膜梭菌α毒素基因的 PCR 扩增
        2.3.2 T-Vector pMD19-α的酶切鉴定
        2.3.3 重组表达质粒 pET-32a-α的构建及鉴定
        2.3.4 α毒素蛋白最佳诱导时间的确定
        2.3.5 α毒素蛋白 IPTG 诱导浓度的确定
        2.3.6 α毒素蛋白的 Western blot 分析
        2.3.7 α毒素重组蛋白的纯化
        2.3.8 α毒素重组蛋白的复性
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三章 抗 C 型产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白特异性 IgY 抗体的制备
    3.1 材料
        3.1.1 试剂
        3.1.2 溶液配制
    3.2 方法
        3.2.1 免疫原制备及免疫
        3.2.2 IgY 抗体提取和鉴定
        3.2.3 间接 ELISA 检测 IgY 抗体效价
        3.2.4 IgY 抗体的 Western blot 鉴定
    3.3 结果与分析
        3.3.1 IgY 抗体的 SDS-PAGE 电泳
        3.3.2 抗体效价动态变化
        3.3.3 Western blot 鉴定
    3.4 讨论
    3.5 小结
结论
参考文献
致谢
作者简介



本文编号：4044076