喹赛多对GH3细胞的基因和蛋白质表达影响研究
发布时间：2025-06-28 02:47
喹赛多是新型喹噁啉类广谱抗菌促生长的动物专用药,其化学结构保留了喹噁啉-1,4-二氧化物母环,同时在其基础上对侧链进行改造,以降低毒性的同时保留其抗菌活性。本实验室现已从基础毒理、抗菌活性、基础代谢和抗菌促生长机理等各方面对喹赛多进行深入研究,以求证实其安全无毒,抗菌促生长的同时阐明其发挥作用的分子机制。2007年,朱慧玲研究了喹赛多对猪体内内分泌的影响,发现喹赛多可以在整体水平调节体内多种重要内分泌因子的表达,其中最值得关注的为生长激素(GH)的上调表达,然而其作用机制尚不清楚。为了阐明喹赛多影响GH合成和分泌的分子机制,本课题以大鼠垂体腺瘤细胞(GH3细胞)暴露于喹赛多为实验材料,运用Afrymetrix公司的GeneChip? Rat Gene1.0ST Array芯片和双向电泳—质谱联用技术,查找喹赛多作用于GH3细胞后差异表达的基因和蛋白,以求更加全面的了解喹赛多作用后GH3细胞内发生的变化。进而通过Gene Ontology, KEGG等进行功能富集分析,找到发挥作用的功能基因组和蛋白质组,综合分析基因组和蛋白组的结果,进而阐明喹赛多影响GH合成和分泌的分子机理。 1.基...
【文章页数】：150 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
1 前言
1.1 喹赛多的研究进展
1.2 GH转录,合成和分泌的研究进展
1.3 本课题研究技术
1.4 研究内容和目标
2 材料方法
2.1 细胞株
2.2 主要试剂
2.3 主要仪器
2.4 主要试剂的配制
2.5 细胞培养及冻存
2.6 细胞总RNA的提取
2.6.1 细胞处理
2.6.2 RNA的提取
2.6.3 RNA浓度测定及质量检测
2.7 cDNA的合成
2.8 实时荧光定量PCR方法检测GHmRNA表达水平的变化
2.8.1 引物设计
2.8.2 实时荧光定量PCR反应体系
2.8.3 实时荧光定量PCR数据分析
2.8.4 统计学分析
2.9 ELISA方法检测GH分泌量的变化
2.9.1 待测样品准备
2.9.2 GH分泌量测定步骤
2.9.3 结果计算
2.10 BCA法检测细胞内总蛋白含量
2.11 Western Blot方法检测GH蛋白表达情况
2.11.1 细胞处理
2.11.2 细胞蛋白提取及浓度测定
2.11.3 SDS-PAGE凝胶电泳
2.11.4 转膜
2.11.5 封闭
2.11.6 一抗孵育
2.11.7 二抗孵育
2.11.8 化学发光显色
2.12 喹赛多对GH3细胞影响的基因表达谱检测
2.12.1 总RNA的提取和纯化
2.12.2 cDNA的合成和纯化
2.12.3 IVT合成cRNA和cRNA的纯化
2.12.4 cRNA片段化
2.12.5 芯片杂交
2.12.6 芯片洗脱
2.12.7 芯片扫描
2.13 实时荧光定量PCR验证基因芯片中差异基因的mRNA表达
2.13.1 引物设计
2.13.2 实时荧光定量PCR反应体系
2.13.3 实时荧光定量PCR数据分析
2.13.4 统计学分析
2.14 双向电泳技术检测GH3细胞差异蛋白质组学研究
2.14.1 细胞处理及分组
2.14.2 细胞总蛋白的制备
2.14.3 蛋白质定量
2.14.4 蛋白质水化上样
2.14.5 一相等点聚焦(IEF)
2.14.6 IPG胶条平衡
2.14.7 二相SDS-PAGE电泳
2.14.8 染色
2.14.9 图像扫描及分析
2.15 蛋白质质谱鉴定
2.15.1 胶内酶解
2.15.2 MALDI-TOF质谱分析及数据库搜索
2.16 Western Blot方法验证差异蛋白的表达情况
2.16.1 细胞处理
2.16.2 细胞蛋白提取及浓度测定
2.16.3 SDS-PAGE凝胶电泳
2.16.4 转膜
2.16.5 封闭
2.16.6 一抗孵育
2.16.7 二抗孵育
2.16.8 化学发光显色
3 结果
3.1 GH3细胞培养
3.2 RNA浓度的测定及质量检测
3.2.1 RNA浓度测定
3.2.2 RNA质量的检测
3.3 喹赛多作用于GH3细胞GHmRNA表达水平的变化
3.3.1 溶解曲线和标准曲线
3.3.2 喹赛多作用于GH3细胞GHmRNA表达水平的变化
3.3.3 PCR产物的验证
3.4 ELISA方法检测喹赛多作用下GH3细胞中GH分泌量的变化
3.4.1 ELISA方法检测GH分泌量的标准曲线
3.4.2 喹赛多作用于GH3细胞GH分泌量的变化
3.5 喹赛多作用于GH3细胞总蛋白的变化
3.6 Western blot检测GH蛋白的表达水平
3.7 基因芯片显示的差异基因分析
3.8 Real-time PCR验证基因芯片中部分差异基因的mRNA表达
3.8.1 相关基因定量溶解曲线和标准曲线
3.8.2 荧光定量PCR验证基因与芯片结果对比情况
3.9 双向电泳寻找喹赛多作用GH3细胞后差异表达蛋白结果
3.9.1 蛋白质定量
3.9.2 喹赛多对GH3细胞差异蛋白质组学分析
3.9.3 差异蛋白点质谱鉴定结果
3.9.4 Western blot验证基因芯片和双向电泳结果
4 讨论
4.1 喹赛多对GH3细胞作用差异基因的分析
4.1.1 喹赛多孵育GH3细胞1h差异表达的基因
4.1.2 喹赛多孵育GH3细胞12h差异表达的基因
4.2 差异基因的功能分析
4.2.1 细胞内信号转导相关基因
4.2.2 调节物质能量代谢相关基因
4.2.3 离子转运相关基因
4.3 喹赛多对GH3细胞作用差异蛋白的分析
4.4 喹赛多对GH3细胞作用差异蛋白功能分析
4.4.1 分子伴侣
4.4.2 细胞转运蛋白
4.4.3 蛋白激酶因子
4.4.4 维持细胞形态相关蛋白
4.4.5 物质代谢与能量代谢
4.5 基因芯片及双向电泳结果之间的关系
4.6 喹赛多影响GH3细胞GH合成和分泌的分子机理
5 全文总结
6 文献综述：药物基因组和蛋白质组研究进展
1 药物基因组学研究进展
1.1 药物基因组学发展简史
1.2 药物基因组概念与基本原理
1.3 药物基因组的主要研究方法
1.3.1 表型和基因型分析
1.3.2 药物效应图谱
1.3.3 连锁分析及关联分析
1.3.4 单核苷酸多态性
1.3.5 基因芯片技术
1.3.6 基因表达连续分析
1.4 药物基因组的研究现状
1.4.1 寻找新药靶
1.4.2 加速新药研发
1.4.3 指导临床合理用药
1.5 药物基因组的发展前景
2 药物蛋白质组的研究进展
2.1 药物蛋白质组的发展简史
2.2 药物蛋白质组的概念与基本原理
2.3 药物蛋白质组的主要研究方法
2.3.1 双向电泳与质谱联用
2.3.2 液相色谱(LC)分离配合质谱(MS)鉴定
2.3.3 生物质谱技术
2.3.4 生物传感芯片质谱技术
2.3.5 同位素标记亲和标签技术(ICAT)
2.3.6 蛋白质芯片
2.3.7 酵母双杂交系统和其他技术
2.4 药物蛋白质组的研究现状
2.4.1 药物靶点的发现
2.4.2 阐明药物作用机制
2.4.3 药物的筛选和新药发现
2.5 药物蛋白质组的发展前景
参考文献
致谢
作者简介
附录
本文编号：4054300
【文章页数】：150 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
1 前言
1.1 喹赛多的研究进展
1.2 GH转录,合成和分泌的研究进展
1.3 本课题研究技术
1.4 研究内容和目标
2 材料方法
2.1 细胞株
2.2 主要试剂
2.3 主要仪器
2.4 主要试剂的配制
2.5 细胞培养及冻存
2.6 细胞总RNA的提取
2.6.1 细胞处理
2.6.2 RNA的提取
2.6.3 RNA浓度测定及质量检测
2.7 cDNA的合成
2.8 实时荧光定量PCR方法检测GHmRNA表达水平的变化
2.8.1 引物设计
2.8.2 实时荧光定量PCR反应体系
2.8.3 实时荧光定量PCR数据分析
2.8.4 统计学分析
2.9 ELISA方法检测GH分泌量的变化
2.9.1 待测样品准备
2.9.2 GH分泌量测定步骤
2.9.3 结果计算
2.10 BCA法检测细胞内总蛋白含量
2.11 Western Blot方法检测GH蛋白表达情况
2.11.1 细胞处理
2.11.2 细胞蛋白提取及浓度测定
2.11.3 SDS-PAGE凝胶电泳
2.11.4 转膜
2.11.5 封闭
2.11.6 一抗孵育
2.11.7 二抗孵育
2.11.8 化学发光显色
2.12 喹赛多对GH3细胞影响的基因表达谱检测
2.12.1 总RNA的提取和纯化
2.12.2 cDNA的合成和纯化
2.12.3 IVT合成cRNA和cRNA的纯化
2.12.4 cRNA片段化
2.12.5 芯片杂交
2.12.6 芯片洗脱
2.12.7 芯片扫描
2.13 实时荧光定量PCR验证基因芯片中差异基因的mRNA表达
2.13.1 引物设计
2.13.2 实时荧光定量PCR反应体系
2.13.3 实时荧光定量PCR数据分析
2.13.4 统计学分析
2.14 双向电泳技术检测GH3细胞差异蛋白质组学研究
2.14.1 细胞处理及分组
2.14.2 细胞总蛋白的制备
2.14.3 蛋白质定量
2.14.4 蛋白质水化上样
2.14.5 一相等点聚焦(IEF)
2.14.6 IPG胶条平衡
2.14.7 二相SDS-PAGE电泳
2.14.8 染色
2.14.9 图像扫描及分析
2.15 蛋白质质谱鉴定
2.15.1 胶内酶解
2.15.2 MALDI-TOF质谱分析及数据库搜索
2.16 Western Blot方法验证差异蛋白的表达情况
2.16.1 细胞处理
2.16.2 细胞蛋白提取及浓度测定
2.16.3 SDS-PAGE凝胶电泳
2.16.4 转膜
2.16.5 封闭
2.16.6 一抗孵育
2.16.7 二抗孵育
2.16.8 化学发光显色
3 结果
3.1 GH3细胞培养
3.2 RNA浓度的测定及质量检测
3.2.1 RNA浓度测定
3.2.2 RNA质量的检测
3.3 喹赛多作用于GH3细胞GHmRNA表达水平的变化
3.3.1 溶解曲线和标准曲线
3.3.2 喹赛多作用于GH3细胞GHmRNA表达水平的变化
3.3.3 PCR产物的验证
3.4 ELISA方法检测喹赛多作用下GH3细胞中GH分泌量的变化
3.4.1 ELISA方法检测GH分泌量的标准曲线
3.4.2 喹赛多作用于GH3细胞GH分泌量的变化
3.5 喹赛多作用于GH3细胞总蛋白的变化
3.6 Western blot检测GH蛋白的表达水平
3.7 基因芯片显示的差异基因分析
3.8 Real-time PCR验证基因芯片中部分差异基因的mRNA表达
3.8.1 相关基因定量溶解曲线和标准曲线
3.8.2 荧光定量PCR验证基因与芯片结果对比情况
3.9 双向电泳寻找喹赛多作用GH3细胞后差异表达蛋白结果
3.9.1 蛋白质定量
3.9.2 喹赛多对GH3细胞差异蛋白质组学分析
3.9.3 差异蛋白点质谱鉴定结果
3.9.4 Western blot验证基因芯片和双向电泳结果
4 讨论
4.1 喹赛多对GH3细胞作用差异基因的分析
4.1.1 喹赛多孵育GH3细胞1h差异表达的基因
4.1.2 喹赛多孵育GH3细胞12h差异表达的基因
4.2 差异基因的功能分析
4.2.1 细胞内信号转导相关基因
4.2.2 调节物质能量代谢相关基因
4.2.3 离子转运相关基因
4.3 喹赛多对GH3细胞作用差异蛋白的分析
4.4 喹赛多对GH3细胞作用差异蛋白功能分析
4.4.1 分子伴侣
4.4.2 细胞转运蛋白
4.4.3 蛋白激酶因子
4.4.4 维持细胞形态相关蛋白
4.4.5 物质代谢与能量代谢
4.5 基因芯片及双向电泳结果之间的关系
4.6 喹赛多影响GH3细胞GH合成和分泌的分子机理
5 全文总结
6 文献综述：药物基因组和蛋白质组研究进展
1 药物基因组学研究进展
1.1 药物基因组学发展简史
1.2 药物基因组概念与基本原理
1.3 药物基因组的主要研究方法
1.3.1 表型和基因型分析
1.3.2 药物效应图谱
1.3.3 连锁分析及关联分析
1.3.4 单核苷酸多态性
1.3.5 基因芯片技术
1.3.6 基因表达连续分析
1.4 药物基因组的研究现状
1.4.1 寻找新药靶
1.4.2 加速新药研发
1.4.3 指导临床合理用药
1.5 药物基因组的发展前景
2 药物蛋白质组的研究进展
2.1 药物蛋白质组的发展简史
2.2 药物蛋白质组的概念与基本原理
2.3 药物蛋白质组的主要研究方法
2.3.1 双向电泳与质谱联用
2.3.2 液相色谱(LC)分离配合质谱(MS)鉴定
2.3.3 生物质谱技术
2.3.4 生物传感芯片质谱技术
2.3.5 同位素标记亲和标签技术(ICAT)
2.3.6 蛋白质芯片
2.3.7 酵母双杂交系统和其他技术
2.4 药物蛋白质组的研究现状
2.4.1 药物靶点的发现
2.4.2 阐明药物作用机制
2.4.3 药物的筛选和新药发现
2.5 药物蛋白质组的发展前景
参考文献
致谢
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附录
本文编号：4054300
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