BVDV/GS01/2010株的分离鉴定及表达E2的gE-/TK-重组伪狂犬病毒的构建

发布时间：2025-07-02 04:52

　　牛病毒性腹泻/黏膜病是危害养牛业健康发展的重要疫病之一，世界动物卫生组织将其列入必须通报的动物传染病。牛病毒性腹泻病临床表现形式复杂、多样，使其预防和控制难度加大。虽然疫苗接种是预防该病的有效途径，但国内目前还没有商品化的牛病毒性腹泻疫苗可供使用，所以研发一种安全、高效的牛病毒性腹泻疫苗是预防和控制该病的主要发展方向。目前，以伪狂犬病毒为载体的新型活载体疫苗已在动物疫病的预防控制中得到了广泛的研究和应用，并显示出其显著的优越性。基于此，本研究在对牛病毒性腹泻病毒甘肃流行株BVDV/GS01/2010分离鉴定的基础上，开展其E2结构蛋白的二级结构、抗原表位等的预测及其同源性和遗传进化分析，重点构建猪伪狂犬病毒gE/TK基因缺失载体，旨在获得牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的gE-/TK-重组伪狂犬病毒。具体如下： 1.利用MDBK细胞从疑似患牛病毒性腹泻病牛的血液中成功分离出一株流行于甘肃省甘南藏族自治州的能致细胞病变的牛病毒性腹泻病毒株，将其命名为BVDV/GS01/2010，并用该病毒人工感染健康犊牛，成功复制出牛病毒性腹泻病例。同时应用生物信息学技术对该分离株病毒的5′-UTR核苷酸序列...

【文章页数】：60 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Summary
英文缩略词表
第一章 文献综述
    一、牛病毒性腹泻-黏膜病毒研究进展
        1 BVDV病原学特性
            1.1 发现与命名
            1.2 主要特性
        2 BVDV基因组及其特征
        3 BVDV的基因分型
        4 BVDV生物型之间转化的机制
        5 BVDV的流行概况
        6 BVDV检测方法
            6.1 病毒分离
            6.2 RT-PCR技术
        7 国内BVD防控现状
        8 国外BVDV疫苗的研制
            8.1 传统疫苗
            8.2 新型疫苗
        9 小结与展望
    二、PRV重组活载体疫苗株的研究进展
        1 PRV概述
        2 PRV活载体基因重组疫苗株的构建及应用
        3 小结与展望
    三、本研究的目的意义
第二章 BVDV/GS01/2010株的分离、鉴定
    摘要
    1 材料
        1.1 病料来源
        1.2 细胞系、菌种及常用试剂
        1.3 实验动物
    2 方法
        2.1 病料处理
        2.2 BVDVRNA提取
        2.3 临床样品的RT-PCR检测
            2.3.1 引物设计与合成
            2.3.2 RT-PCR检测
        2.4 BVDV5′-UTR核苷酸序列的生物信息学分析
        2.5 病毒的分离
        2.6 病毒的鉴定
            2.6.1 病毒粒子的电镜观察
            2.6.2 TCID50的测定
            2.6.3 本动物回归试验
    3 结果
        3.1 临床样品的RT-PCR检测
        3.2 5′-UTR序列的测定及其分析
        3.3 病毒分离
        3.4 病毒电镜观察
        3.5 TCID50测定
        3.6 本动物回归实验
    4 讨论
第三章 BVDV/GS01/2010流行毒株E2基因的克隆及生物信息学分析
    摘要
    1 材料
        1.1 毒株及细胞
        1.2 主要试剂
    2 方法
        2.1 E2基因的克隆
        2.2 E2蛋白二级结构及抗原表位的预测
        2.3 E2基因的遗传进化分析
    3 结果
        3.1 E2基因的克隆
        3.2 E2蛋白二级结构预测
        3.3 E2蛋白的亲水性分析
        3.4 E2蛋白的表面可能性分析
        3.5 E2蛋白抗原表位的预测分析
        3.6 E2基因核苷酸序列同源性比较
        3.7 E2基因推导氨基酸同源性分析
        3.8 E2基因系统进化树的构建
    4 讨论
第四章 表达BVDVE2基因的重组PRV病毒的构建
    摘要
    1 材料
        1.1 毒株与细胞系
        1.2 主要试剂
    2 方法
        2.1 引物设计和合成
        2.2 PRVBarthaK61疫苗株的细胞增殖及其DNA的提取
        2.3 BVDV/GS01/2010株RNA的提取
        2.4 目的基因的获得
        2.5 pTK-转移载体的构建
        2.6 pTK-/EGFP通用转移载体的构建
        2.7 pTK-/EGFP/E2转移载体的构建
        2.8 PRV/gE-/TK-/EGFP/E2重组病毒的构建
            2.8.1 pTK-/EGFP/E2质粒的提取
            2.8.2 共转染
            2.8.3 蚀斑筛选
            2.8.4 PCR鉴定
    3 结果
        3.1 目的基因的获得
        3.2 pTK-转移载体的酶切鉴定
        3.3 pTK-/EGFP通用转移载体的鉴定
        3.4 pTK-/EGFP/E2转移载体的构建及鉴定
        3.5 PRV/gE-/TK-/EGFP/E2重组病毒的筛选
        3.6 PRV/gE-/TK-/EGFP/E2重组病毒的PCR鉴定
    4 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
导师简介
作者简介



本文编号：4055266