一株粗糙型牛种布鲁氏菌诱导株的构建及鉴定

发布时间：2025-07-03 00:17

　　 本试验旨在研究布鲁氏菌病疫苗的新型研制方法,并通过op诱导剂成功诱导出一株粗糙型牛种布鲁氏菌弱毒株,命名为RB71。试验检测了RB71相关基因的缺失情况,并对其脂多糖完整性、生长特性、遗传稳定性以及在小鼠巨噬细胞(RAW264.7)中生存能力等与光滑型菌株进行了比较研究。结果显示,试验成功获得了诱导突变株,其缺失片段大小为15 070 bp;热凝集试验阳性,能被结晶紫染色,吖啶黄凝集试验阳性;对提取脂多糖进行银染,结果显示O链缺失,诱导株RB71脂多糖不完整;连续传代30次,PCR检测未发现基因回复突变;在体外相同培养条件下,诱导株RB71生长速度显著低于亲本株A19;入侵RAW264.7细胞72 h时,其胞内存活率与亲本株相比极显著下降(P<0.01)。综上所述,本试验开发出一种能高效诱导光滑型布鲁氏菌变异为粗糙型布鲁氏菌的试剂及诱导方法,成功获得一株具有良好遗传稳定性的粗糙型减毒布鲁氏菌RB71诱导株,该诱导株在RAW264.7细胞内的存活能力显著变弱,这为新型弱毒布鲁氏菌粗糙型疫苗的研制奠定技术基础。

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【部分图文】：

图1 诱导菌株初筛及表型鉴定

对诱导初代菌落进行结晶紫染色鉴定(图1)。用放大镜观察菌落边缘着色情况发现,1号菌落边缘不着色,整齐,圆润;2号菌落边缘着色,界限不清晰。挑取1和2号单菌落扩大培养,并对其表型进行鉴定。热凝集试验结果显示,1号菌株菌液不产生沉淀依旧混浊,2号菌株菌液出现絮状沉淀而液体清亮(图1A....

图2 PCR检测布鲁氏菌脂多糖合成相关基因

根据表1引物序列,进行PCR扩增,检测布鲁氏菌脂多糖合成相关基因缺失情况,结果如图2所示。从图2可以看出第13和14泳道,亲本株A19有目的条带,而诱导缺失株RB71未出现条带,推测布鲁氏菌RB71菌株中wboA和wboB基因缺失。2.2.2诱导株部分缺失基因范围的检测

图7 诱导株RB71与亲本株A19的生长曲线

汇总所测D600nm值,绘制诱导株RB71和亲本株A19生长曲线(图7)。由图7可知,RB71进入生长对数期的时间及稳定期的时间晚于亲本株,A19株可在培养44h后到达稳定期,而RB71则需要培养52h才进入稳定期,并且RB71稳定期的细菌浓度显著低于A19,说明RB71基....

图4 诱导株RB71缺失鉴定

图3诱导株RB71部分基因缺失范围的测定2.3细菌脂多糖完整性鉴定

本文编号：4055464