改造HBV作为肝靶向性基因治疗载体的研究

发布时间：2025-05-11 02:37

　　目 的 HBV具备改造作为肝靶向性基因治疗载体的基本条件：天然嗜肝特异性；能够在肝细胞内持续复制、反复感染，病毒本身对细胞无明显细胞毒性；能够携带外源基因并被包装成病毒颗粒，介导目的基因转移和表达。但因基因结构复杂，目前改造的HBV载体系统均存在载容量小、复制包装效率低及安全性差等缺点。基于此，本课题借鉴体内天然HBV变异株的生物学特性，优化HBV载体改造策略，探索性构建C基因截短型HBV载体，并对其表达、复制、包装等分子生物学特性进行探讨。 方 法 1. 用外源GFP报告基因取代野生HBV质粒pHBV3091 S基因编码区，同时保留S基因前9个碱基与GFP融合，构建携带外源报告基因的HBV载体pHBV-S-GFP。应用脂质体单独转染该HBV重组体，以GFP表达阳性质粒pCMV-GFP作对照，荧光显微镜下观察GFP在肝细胞中表达。重组体pHBV-S-GFP与缺失包装信号ε的辅助质粒pHBV3142共转染HepG2细胞，提取细胞核中病毒DNA，根据HBV 基因组复制特点设计包含GFP及HBV DNA序列在内的特异性引物，半巢式...

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【学位级别】：博士

【部分图文】：

图1-4中间质粒产物pGEM-HBV(clone2)DNA测序结果

所有中间质粒产物经酶切、测序验证均与预期结果吻合，最终证实携带外源GFP报告基因的重组HBV载体pHBV-S-GFP构建成功。见图1-3~图1-6。图1-4中间质粒产物pGEM-HBV(clone2)DNA测序结果2000bp1000bp100bp200bp....

图1-9半巢式PCR检测转染细胞中携带GFP基因的HBVcccDNA

约870bp的HBVDNA片段（从P基因翻译起始密码子到EcoRI酶切位点的HBV基因片段，见图1-2）及长约720bp的GFP基因片段，见图1-10。野图1-9半巢式PCR检测转染细胞中携带GFP基因的HBVcccDNA。Lane2、l....

图1-10PCR检测上清液中子代病毒DNALane1:200bpDNAmarker；Lane2:pHBV-S-GFP+pHBV3142

第三军医大学博士学位论文pHBV3091单独转染后，在上清液提取物中仅扩增产物，而没有扩增出相应的GFP产物（资料未显示lot检测上清液中子代病毒颗粒的包装GFP载体单独转染后，上清液中子代病毒颗粒提信号，相反与缺失包装信号ε的辅助质粒pHBV3可见到各种构型的H....

图2-4Southernblot检测胞浆中HBVDNA复制中间体

第三军医大学博士学位论文截短型HBV突变体在辅助质粒pHBV3142辅到恢复nblot分析C基因截短导致HBV突变体复制包装能力丧HBVΔC188和pHBVΔC141分别单独转染HepG2液中HBV病毒颗粒DNA进行S....

本文编号：4044719