共聚焦荧光显微光学切片断层成像

发布时间：2018-12-20 05:58

【摘要】：正如美国总统奥巴马2013年在一次新闻发布会上所说,“我们可以探索数光年之外的星系,却对两只耳朵之间三磅重的大脑知之甚少”。脑神经回路结构复杂多样,一个简单的脑功能往往需要多个类型的脑神经回路共同作用,在全脑范围内获取神经回路结构图是理解脑功能和脑疾病的基础。荧光标记技术已成为特异性标记功能脑神经回路的重要工具,国际上,使用荧光标记结合光学成像的方法在解析局部神经回路上取得了较大的进展,但是以微米分辨率在全脑尺度获取和追踪长程的神经回路缺乏仍然是个挑战。如何以微米高分辨率成像厘米尺度的荧光标记的全脑神经回路,是高分辨获取全脑神经回路的三维荧光结构图的难点之一。显微光学切片断层成像系统(MOST)已完整获取亚微米分辨的厘米尺度的小鼠全脑图谱,但是MOST是基于吸收的宽场反射成像,当进行荧光成像时会遇到较大的背景荧光干扰,恶化了空间分辨率和信噪比。针对这个问题,本文提出以共聚焦方式在刀面上实现光学层析,以抑制MOST荧光成像的高散射背景荧光干扰,从而实现了高分辨率荧光MOST成像；引入共聚焦扫描成像的荧光MOST为点扫描成像,相对原来宽场线扫描的方式,扫描速度明显下降,不利于全脑尺度的大体积成像。本文探讨了适用于MOST荧光共聚焦成像的不同快速扫描原理的可能性,并最终选用了声光原理的无惯性扫描实现快速高稳定地扫描。为进一步提高扫描通量,本文提出通过缩束扩大扫描角,提高了线性啁啾扫描时的视场而不损失其成像速度,保证了高通量地快速成像；扫描器声光偏转器在快速啁啾扫描时产生了像散,恶化了空间分辨率。本文分析了像散产生的原因以及对成像分辨率的影响,使用长焦距柱透镜补偿了像散的同时减低了透镜位置敏感性和调节难度,从而保证了亚微米的光学空间分辨率。以高信噪比成像单根轴突的长程投射,是高分辨获取全脑神经回路的三维荧光结构图的另一难点问题。基于共聚焦的荧光MOST成像是在刀具切削样本的同时,在刀面上对薄片样本进行点扫描线探测的特殊的成像结构。本文系统分析了基于共聚焦的荧光MOST成像中信噪比的影响因素,提出了针对本系统的提高信号强度,减少背景荧光激发和减少背景荧光探测的方法,得到了系统最优的信噪比,保证了在大体积范围内清晰成像单根轴突。为了减少背景荧光激发,本文研究了系统特殊的刀面上成像结构,使用三维点扩散函数模型对刀面激光光锥被抬高距离与成像信噪比的关系进行了仿真模拟研究,发现通过在刀面上一定高度位置的成像,实现了把激发光锥抬高,一定程度分离了焦面薄片样本和下层背景荧光样本块,减少了背景荧光的激发。结合了共聚焦层析后,能够在普通共聚焦显微成像基础上进一步提高成像信噪比和轴向分辨率。部分切片伸出刀外产生毛边,探测时受背景荧光干扰淹没在噪声中,造成了相邻切片间的连接信息丢失,本文通过探索优化的狭缝宽度减少了背景荧光的探测,去除了伸出刀外毛边的大部分的背景荧光干扰,恢复了相邻切片间的连接信息,保证了大体积数据的完整性。在上述工作基础上,本文发展了一套高稳定和自动化的共聚焦荧光显微光学切片断层成像系统(Confocal Fluorescence Micro-Optical Sectioning Tomography, Confocal-fMOST)。设计实现了基于状态机模式的高稳定可靠的扫描成像程序,实现了扫描成像和切削运动的精确同步,对于系统关键部分的软硬件进行了稳定性设计与测试。本系统可对样本体积达到28cm×4.5cm×2cm立方厘米的样本实现1微米体素分辨率(1μm×1μm×1μm)的荧光成像,并能保持10天以上24小时不间断的稳定运行,实现了在10天以内完成一只完整小鼠全脑神经回路的数据获取。通过对小鼠全脑范围内的胞体和神经突等结构进行高信噪比和高三维空间分辨率的成像,本系统成功获取了一套Thy1-eYFP-H转基因小鼠的全脑数据集,利用所获取的数据集在世界上首次实现了在小鼠全脑范围内追踪单根轴突的长程投射。该系统以微米级体素分辨率和长时间高稳定成像能力,为探索局部和长程神经回路提供了重要研究手段,展现了其在神经科学研究应用中的巨大潜力。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R318

【参考文献】