紧密连接蛋白Claudin-1在丙型肝炎病毒感染中作用的研究

发布时间：2020-06-03 01:39

【摘要】： 丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)是引起人类丙型肝炎的病原体,其慢性化率高达85%,与肝硬化、肝细胞癌的发生密切相关,严重危害人类健康,已成为全球性的、重要的公共卫生问题。迄今,对HCV感染发病的机制认识不完全清楚,仍然缺乏有效的治疗方法,疫苗的研究也遇到很大障碍。在HCV感染过程中,病毒与细胞表面相应受体的结合是病毒感染复制的始动环节,因此探索HCV的受体在HCV感染发病中的作用一直是研究的热点问题。CD81、B族I型清道夫受体(scavenger receptor class B type I, SR-BI)与HCV包膜蛋白结合,参与HCV的入胞过程,目前已经证实,CD81和SR-BI同时存在是HCV感染肝细胞的必要条件,但一些非肝源细胞同时表达CD81和SR-BI,仍然不能被HCV感染,说明HCV感染肝细胞可能需要其它特异性因子的共同参与。最新研究发现,肝脏上高度表达的claudin-1在HCV入胞过程中发挥重要的作用,非肝源细胞在表达该分子后获得对HCV的易感性。Claudin-1是构成细胞间紧密连接的主要蛋白,有4个疏水的跨膜区,2个细胞外环结构(extracellular loop, EL),EL1与HCV入胞密切相关,针对claudin-1 EL1的抗体可以阻断HCV的感染;此外,claudin-1在介导细胞间HCV的传播中起关键作用,细胞间HCV传播可逃避宿主免疫系统中和抗体的作用,可能是HCV在宿主体内持续存在的重要原因。因此,深入研究claudin-1在HCV感染中的作用,有助于加深对HCV感染发病机制的理解,为抗病毒治疗提供新的思路。长期以来,缺乏可靠的供病毒繁殖与传播的细胞培养系统一直制约着HCV的研究,2005年Rockefeller大学HCV研究中心主任Charles M. Rice教授领导的实验室报道建立HCV感染细胞模型,解决了这一瓶颈问题。Rice教授惠赠的HCV体外培养系统(cell-culture derived HCV, HCVcc),为我们的研究奠定了良好的基础。为探讨claudin-1在HCV感染中的作用,本研究主要完成了以下三方面的工作: 1 HCV体外培养系统使用Rice教授惠赠的包含HCV全长序列的2a型J6/JFH嵌合体质粒,酶切线性化后作为模版,在T7 RNA聚合酶的作用下,体外转录获得全长HCV转录本,产物经RNA电泳鉴定,并电穿孔转染至Huh-7.5细胞,包装出病毒颗粒,重新感染原始的(na?ve)Huh-7.5细胞,并检测病毒感染性。 2 Claudin-1表达对HCVcc易感性的影响从HepG2细胞中克隆claudin-1基因,插入pEGFP-C3载体中,构建真核表达载体,脂质体法转染293T细胞,荧光显微镜与Western blot观察claudin-1的表达,检测claudin-1对HCVcc感染的影响;使用化学合成claudin-1 siRNA序列,抑制Huh-7.5细胞中claudin-1的表达,检测HCVcc感染性的变化。 3γ干扰素对紧密连接的影响及其对HCV感染的影响γ干扰素是促炎细胞因子,可影响细胞紧密连接;γ干扰素还参与抗HCV免疫应答,本研究对γ干扰素在紧密连接及HCV易感性之间的作用初步探索。Transwell PET膜上培养的肠腺癌细胞系Caco-2细胞可形成极性结构,与体内的肝细胞相似,采用实时定量PCR与Western blot检测Caco-2细胞上的claudin-1、CD81及SR-BI的表达情况。比较Caco-2单层细胞在γ干扰素处理前后跨上皮电阻、FITC标记的葡聚糖渗透性以及Caco-2细胞间紧密连接超微结构的变化,通过激光共聚焦显微镜观察CD81、SR-BI及claudin-1在Caco-2细胞上的分布情况,检测γ干扰素对HCVcc感染性的影响。结果: 1通过体外转录获得了FL-J6/JFH全长嵌合体HCV RNA转录本,经电穿孔转染Huh-7.5细胞,在培养上清中检测到HCV,用该培养上清可以感染原始的Huh-7.5细胞。 2从HepG2细胞中克隆claudin-1基因,成功构建了claudin-1的真核表达载体pEGFP-claudin-1,脂质体法转染293T细胞,48 h后可检测到融合蛋白EGFP-claudin-1在293T细胞中的表达。293T细胞上外源性瞬时表达claudin-1后,获得对HCVcc的易感性。 3化学合成的siRNA序列可以有效抑制Huh-7.5细胞上的claudin-1的表达,并阻断HCVcc对Huh-7.5细胞的感染。 4 Caco-2细胞表达HCV的关键受体:CD81、SR-BI及claudin-1,支持HCVcc的感染。 5γ干扰素可以下调claudin-1的表达,造成Caco-2细胞间紧密连接被破坏,通透性增加。γ干扰素同时影响claudin-1、CD81及SR-BI在细胞上的分布。γ干扰素处理后Caco-2细胞对HCVcc的易感性下降。结论: 1紧密连结蛋白claudin-1是HCV的重要受体,影响细胞对HCV的易感性,可能与HCV的嗜肝性有关。 2γ干扰素可以降低claudin-1的表达,破坏紧密连接,使CD81及SR-BI的分布发生变化,可能影响细胞对HCV的易感性。
【图文】：

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13图 1 HCV 入胞示意图[13]1.1 CD81CD81 分子是一种非糖基化膜蛋白，有 236 个氨基酸残基，分子量为25.8 kD。因它对于人 T 淋巴细胞系的增殖反应具有显著的抑制作用而被命名为抗增生抗体识别的靶抗原（target of antiproliferative antibody-1,TAPA-1），后统一命名为 CD81。它属于四次跨膜蛋白（teraspanin）超家族（TM4SF）成员，含有 4 个跨膜区和 2 个胞外区，N、C 端均在胞内。四次跨膜蛋白的基本特征是它们通过同源或是异源蛋白交联形成多聚体，在细

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第四军医大学博士学位论文NS4B 蛋白是膜蛋白；NS5A 蛋白在细胞中以磷酸化形式存在，可以结合NS5B 蛋白并调节其功能，其序列中具有干扰素敏感决定区。NS5B 蛋白具有 RNA 依赖的 RNA 聚合酶活性（RNA-dependent RNApolymerase, RdRp），负责 HCV 基因组 RNA 的复制[42,43]。3’-NCR 由高变区、多聚嘧啶区(polyU/UC)组成，对 RNA 复制起关键作用。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R512.63

【参考文献】