分子改造L-氨基酸脱氨酶生产α-酮缬氨酸

发布时间：2025-04-26 21:48

　　α-酮缬氨酸（KIV）是生物合成中的重要中间体,广泛应用于食品、饲料、医药和化学合成等行业。目前,KIV可通过化学合成法、微生物发酵法和酶转化法合成。化学法合成KIV步骤多,且需要苛刻的生产条件。微生物发酵法存在发酵周期长、产量低等缺点。相比而言,酶转化法具有底物转化率高、产量高、产物易分离、环境污染小等优点,适合KIV的生产。本研究以大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）为宿主,对来源于Proteus mirabilis的L-氨基酸脱氨酶（PmLAAD）进行异源表达,从而构建了重组菌株E.coli BL21（pET-28a-Pm LAAD）,利用该酶催化底物L-缬氨酸（L-Val）合成产物KIV,并利用蛋白质工程改造、菌株产酶条件优化、全细胞转化条件优化以及罐上转化条件优化等手段进一步提高了L-氨基酸脱氨酶合成KIV的效率,论文主要内容如下:（1）成功构建了含有L-氨基酸脱氨酶基因的重组大肠杆菌E.coli BL21（pET-28a-PmLAAD）,该基因来源于P.mirabilis。利用重组菌株催化底物L-Val制备KIV,评估结果表明,当底物浓度超过20 g·...

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图1-2海因法合成α-酮缬氨酸

化学合成法生产α-酮酸最为常用,它又可具体细分为:酰基氰化物水解法,氧化法,格氏试剂法,海因法等[7]。在这些化学合成法中,KIV生产最常用的化学合成法是格氏试剂法和海因法。格氏试剂法是以草酸二乙酯和格氏试剂为反应起始化合物,且反应需在乙醚中进行。该反应步骤少,产品得率高。但是需....

图1-3具有脱氨或者转氨功能的四种酶

与前两种生产方法相比,酶转化法生产KIV是一种绿色、经济、高效的生产方式。这种生产方式一般具有底物单一,底物转化率和生产强度高,反应时间较短,反应步骤较少等优点。因此,酶转化法生产化学品在近年来获得了广泛的关注和发展。酶转化法是以L-Val为底物,通过脱氨基作用或者转氨基作用制备....

图3-1 Pm LAAD经诱导表达后的SDS-PAGE图

为了验证构建的L-氨基酸脱氨酶基因重组菌是否在大肠杆菌中成功表达了LAAD,对该菌株进行了诱导表达。将重组菌pET-28a-PmLAAD在LB中进行过夜培养后,以2%的接种量转接入TB培养基中,在TB培养基中培养至OD600为0.6,添加0.4mmol·L-1的IPTG诱导1....

图3-2底物浓度对制备KIV的影响

为了考察L-氨基酸脱氨酶重组菌pET-28a-PmLAAD催化L-Val制备KIV的能力,在25oC,pH8.0和10g·L-1全细胞催化剂的条件下,研究了不同底物浓度对转化反应的影响。结果如图3-2所示,当底物浓度从10g·L-1增加至60g·L-1时,KIV的产量从....

本文编号：4041415