利用酵母双杂交技术筛选与生殖支原体黏附蛋白(MgPa)相互作用的宿主蛋白
发布时间:2025-07-19 02:36
从利用基于分离的泛素介导膜蛋白酵母双杂交系统构建的人尿道上皮细胞cDNA文库中筛选生殖支原体(Mg)黏附蛋白(MgPa)的互作蛋白。以pET30a-MgPa为模板,经PCR扩增MgPa基因,将其分别连接到pBT3STE和pBT3SUC载体以构建诱饵质粒pBT3STE-MgPa和pBT3SUC-MgPa;将诱饵质粒分别转化到酵母菌株NMY32内,检测其毒性和自激活活性;将人尿道上皮细胞cDNA文库质粒pPR3-N-207-Zeng转入到含pBT3SUC-MgPa诱饵质粒的酵母菌株中,筛选阳性克隆。检测阳性克隆LacZ报告基因的活性。提取阳性克隆质粒进行DNA测序与BLAST分析。结果显示,成功构建的诱饵质粒pBT3STE-MgPa和pBT3SUC-MgPa两者都没有自激活功能,且pBT3SUC-MgPa的活性强于pBT3STE-MgPa。用pBT3SUC-MgPa转化NMY32酵母作为受体酵母细胞。经DNA测序与BLAST分析结果表明筛选到的28个阳性克隆归属于23个不同的蛋白。从利用分离的泛素介导膜蛋白酵母双杂交系统构建的人尿道上皮细胞cDNA文库中筛选到23个与MgPa相互作用的蛋白...
【文章页数】:6 页
【文章目录】:
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒与质粒提取试剂盒
1.1.2 培养基 (%, 质量分数)
1.1.3 酶
1.2 方法
1.2.1 诱饵载体构建
1.2.2 酵母转化
1.2.3 文库筛选与转化
1.2.4 His和Ade报告基因检测
1.2.5 阳性克隆激活LacZ报告基因的检测
1.2.6 酵母阳性克隆DNA提取和测序比对
2 结果与分析
2.1 PCR扩增得到MgPa片段
2.2 诱饵质粒pBT3STE-MgPa和pBT3SUC-MgPa的鉴定
2.3 MgPa重组质粒自激活及其功能检测
2.4 文库筛选
2.5 His和Ade报告基因检测
2.6 LacZ报告基因检测
2.7 酵母阳性克隆DNA提取和测序比对
3 讨 论
本文编号:4057848
【文章页数】:6 页
【文章目录】:
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒与质粒提取试剂盒
1.1.2 培养基 (%, 质量分数)
1.1.3 酶
1.2 方法
1.2.1 诱饵载体构建
1.2.2 酵母转化
1.2.3 文库筛选与转化
1.2.4 His和Ade报告基因检测
1.2.5 阳性克隆激活LacZ报告基因的检测
1.2.6 酵母阳性克隆DNA提取和测序比对
2 结果与分析
2.1 PCR扩增得到MgPa片段
2.2 诱饵质粒pBT3STE-MgPa和pBT3SUC-MgPa的鉴定
2.3 MgPa重组质粒自激活及其功能检测
2.4 文库筛选
2.5 His和Ade报告基因检测
2.6 LacZ报告基因检测
2.7 酵母阳性克隆DNA提取和测序比对
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