多房棘球绦虫丝氨酸蛋白酶基因的克

发布时间：2025-05-07 23:00

　　 目的克隆多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis, Em)丝氨酸蛋白酶(SP)基因,通过原核系统表达Em-SP并对其抗原性进行鉴定。方法 PCR扩增获得Em-SP片段;构建重组质粒pET30a-Em-SP,NdeI/HindIII双酶切并测序,将测序正确的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)菌株中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,采用SDS-PAGE电泳分析表达蛋白的分子质量单位和表达丰度。表达产物经亲和层析(Ni-IDA树脂)纯化后采用Western blot鉴定蛋白的反应原性。结果 PCR扩增SP基因片段为1 374 bp,重组质粒pET30a-Em-SP酶切后电泳和测序表明阅读框架序列与设计一致。IPTG诱导重组质粒转化菌表达蛋白主要以包涵体形式存在,表达蛋白的相对分子质量约为51×10～3,与预期值大小相符,且能被鼠抗His-Tag抗体识别,用包虫患者血清Western blot鉴定呈阳性。结论克隆的Em-SP基因在原核中成功表达,表达产物具有良好的反应原性,可作为诊断试剂的候选抗原。

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【文章目录】：
材料与方法
    1 材料
        1.1 虫体
        1.2 主要试剂
    2 方法
        2.1 Em-SP基因的扩增
        2.2 Em-SP基因编码氨基酸同源序列分析及进化树构建
        2.3 pET30a-Em-SP重组质粒的构建
        2.4 重组蛋白的表达
        2.5 重组蛋白Em-SP的纯化
        2.6 重组蛋白Em-SP的Western blot鉴定
        2.7 重组蛋白Em-SP反应原性鉴定
结 果
    1 Em-SP基因PCR扩增
    2 Em-SP基因编码氨基酸同源性分析
    3 pET30a-Em-SP重组质粒的酶切鉴定
    4 重组蛋白Em-SP的表达
    5 重组蛋白Em-SP的Western blot鉴定结果
讨 论



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