建立一种基因型转换突变富集技术用于ctDNA中BRAF V600E的检测

发布时间：2025-06-20 05:20

　　研究背景:液体活检是一种非常有前景的非侵入性的检测手段,广泛应用于肿瘤的早期诊断、疗效评估、复发监控等;其检测对象为从原发肿瘤和/或转移性沉积物释放到外周血中的循环肿瘤细胞和无细胞循环核酸。循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ct DNA)是肿瘤早期诊断、治疗及预后检测等方面最有前途的生物标志物之一,其携带肿瘤的基因突变和甲基化信息等,这些信息有助于肿瘤的诊断、定位、耐药情况分析等。ct DNA的检测技术主要分为PCR技术和测序技术两大类。微滴式数字PCR(Droplet Digital PCR,dd PCR)检测灵敏度高,但高成本、低通量制约了其广泛的临床应用。传统PCR和荧光定量PCR是目前临床应用最广的基因突变检测平台,但是PCR方法对于ct DNA或者稀有突变的检测具有很大的局限性。虽然,在PCR基础上改良的稀有突变检测技术,如AMRS-PCR(Amplification Refractory Mutation System-PCR)、COLD-PCR(Coamplification at Lower Denaturation Temperature PC...

【文章页数】：75 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图1 基因型转换突变富集技术原理图

采用基因定点突变的方法构建BRAFV600E的野生型和突变型质粒,测序结果可见(图2),野生型的碱基序列T,突变型的碱基序列为A,其余的碱基序列均一致,证明质粒模板构建成功,可用于后续的方法建立。图2BRAFV600E野生型和突变型质粒模板测序鉴定

图2 BRAF V600E野生型和突变型质粒模板测序鉴定

图1基因型转换突变富集技术原理图4.3限制性内切酶TscAI对BRAFV600E突变的识别能力分析

图3 限制性内切酶Tsc AI对BRAF V600E野生型模板和突变型模板的酶切效果

BRAF基因V600E突变的位置序列为:TACAGTGAA,正好与限制性内切酶TscAI的识别位点(NNCASTGNN,S=C/G)相同,因此BRAF基因的野生型模板可被TscAI识别和酶切。当BRAF基因为突变型时,序列变成TACAGAGAA,由于识别序列的改变,TscA....

图4 Hot Star Taq Plus DNA聚合酶在不同的Buffer下扩增情况

本研究建立的方法设计两种不同酶(一种DNA聚合酶和一种限制性内切酶)在同一个体系中进行反应,如何确保两种酶均能高效的工作是该技术建立的关键。反应Buffer对酶的活性十分重要,许多酶只有在特定的反应Buffer中才有强活性,在别的反应Buffer中活性下降明显甚至失活。本方法选用....

本文编号：4051487