用转座子系统构建IFNβ诱导mCherry转基因小鼠模型

发布时间：2025-06-24 02:51

　　在高等生物的免疫系统中,先天免疫系统与后天免疫系统相互协作,共同抵御着外源病原体入侵以及维持机体健康。先天免疫作为防御外源病原体入侵的第一道防线,更是首当其冲,不可或缺的。而在先天免疫中,干扰素作为其中的一类高活性的天然糖蛋白,在抗病毒、抗增生以及免疫调节中发挥着重要作用。目前发现的先天免疫通路中包括TLR、RIG-I以及cGAS-STING通路都会在机体受到相应的病原体相关分子模式的刺激下诱导产生Ⅰ型干扰素,从而发挥抗病抗毒作用。此外还有研究表明IFNβ对于肿瘤的治疗有一定的帮助。干扰素作为天然免疫应答的重要指示剂,检测其表达位点以及水平显得尤为重要。然而,干扰素只在一些类细胞中表达,一旦释放到血液中后将被稀释,使得检测的灵敏度要求较高。另一方面,由于绿色荧光背景较高,不方便准确观察,为此我们选择红色荧光mCherry来作为由IFNβ启动子诱导表达蛋白转来构建转基因小鼠模型。我们利用已经优化截短后的IFNβ启动子连接mCherry蛋白并在细胞水平验证了其可行性。然后将Sleeping beauty转座子/转座酶系统的质粒通过显微注射到小鼠胚胎中,将注射后的胚胎移植到假孕母鼠中,通过对子...

【文章页数】：82 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图2.3.1.1 HT-DNA、c GAMP、POLY(I:C)、LPS和HSV-1处理L929后IFNβmRNA表达量

在我们利用HT-DNA、cGAMP、POLY(I:C)、LPS和HSV-1处理细胞后,qPCR结果显示IFNβ对于HT-DNA、cGAMP、POLY(I:C)的响应较为强烈,对LPS没有响应,是因为LPS在细胞内的主要受体是TLR4,而我们使用的L929细胞不表达TLR4,所以....

图2.3.2 HT-DNA、c GAMP和POLY(I:C)刺激L929后p-IRF3的表达

HT-DNA在进入细胞后会被cGAS识别并结合到cGAS上,cGAS以ATP和GTP为底物合成第二信使cGAMP,cGAMP结合STING后招募下游的TANK结合激酶1(TANK-bindingkinase1,TBK1),从而促进干扰素调节因子3(IFNregula....

图2.3.3.1 IFNβ刺激L929后的ISG15(A)and IFIT1(B)mRNA相对表达量

我们先将IFNβ蛋白稀释成四个梯度浓度,我们取这四个以上各浓度的IFNβ蛋白加入到被1mL培养基覆盖的L929细胞中,最终IFNβ的工作浓度为2.5ng/mL、25ng/mL、250ng/mL和6h后提取总RNA,反转录成cDNA,qPCR结果表明不同浓度的IFNβ蛋....

图2.3.3.2不同浓度IFNβ对HSV-1的抵抗效果

同时,我们在L929细胞中检测了干扰素对HSV-1感染的抑制效果。我们将IFNβ的最终工作浓度为定为2.5ng/mL、25ng/mL和250ng/mL。6小时后添加HSV-1病毒进行感染。分别在24h,48h,72h观察细胞状态并计算细胞活率。结果表明在终浓度为2.5....

本文编号：4052381