人GINS2基因酵母双杂交诱饵质粒的构建及自激活检测

发布时间：2025-06-26 04:59

　　 目的构建人GINS2基因酵母双杂交诱饵质粒,并进行自激活检测。方法根据GenBank中登录的GINS2基因编码区序列（NM₀16095）设计引物,以pCDNA3. 1-GINS2质粒为模板进行PCR扩增,将PCR产物克隆至诱饵载体pGBKT7上,构建诱饵质粒pGBKT7-GINS2。将鉴定正确的诱饵质粒及对照质粒共同转化至酵母细胞AH109中培养,Western blot法检测诱饵蛋白GINS2的表达,随机挑取6个菌落,进行His3、Ade2及LacZ报告基因的自激活效应检测。结果经双酶切及测序鉴定证明诱饵质粒pGBKT7-GINS2构建正确。诱饵蛋白GINS2相对分子质量为21 000,可在AH109酵母细胞中稳定表达。诱饵质粒转化的酵母细胞在SD/-Trp/-Leu缺陷平板生长,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷平板上不生长,表明报告基因His、Ade2未被激活,报告基因LacZ检测结果与阴性对照相同,表明诱饵蛋白GINS2不存在自激活。结论成功构建了人GINS2基因酵母双杂交诱饵质粒,其表达蛋白对酵母AH109细胞无毒性,也无自激活现象,可用...

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【部分图文】：

图1 GINS2基因PCR产物电泳图

经Westernblot分析，诱饵蛋白GINS2的相对分子质量约为21000，大小与预期结果一致，见图3。表明该诱饵蛋白在AH109酵母细胞中能稳定表达。图2重组质粒pGBKT7-GINS2的双酶切鉴定（EcoRⅠ/BamHⅠ）

图2 重组质粒pGBKT7-GINS2的双酶切鉴定（EcoRⅠ/BamHⅠ）

图1GINS2基因PCR产物电泳图图3诱饵蛋白GINS2的Westernblot分析

图3 诱饵蛋白GINS2的Western blot分析

图2重组质粒pGBKT7-GINS2的双酶切鉴定（EcoRⅠ/BamHⅠ）2.4诱饵蛋白的自激活检测

图4 GINS2蛋白的自激活检测

阴性对照、阳性对照及诱饵质粒组转化的菌落可在SD/-Trp/-Leu缺陷平板正常生长，仅有阳性对照组转化的菌落可在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷平板上生长，而阴性对照及诱饵质粒组不生长，表明报告基因His3、Ade2未被激活。报告基因LacZ的检测结果与阴性对照....

本文编号：4053196