半夏组培优化，PTA保守结构域研究及转PTA浮萍的构建

发布时间：2025-05-11 00:53

　　半夏,Pinellia ternata(Thunb.)Breit,天南星科半夏属多年生草本植物,块茎可入药,是我国常用中药之一,2015年最新药典记录其有湿痰寒痰,咳喘痰多,痰饮眩悸,风痰眩晕,痰厥头痛,呕吐反胃,胸脘痞闷,梅核气;外治痈肿痰核等功效。半夏凝集素为半夏中提取分离出的一种具有高度专一性凝结甘露糖的蛋白,常与草酸钙晶体伴生,或佚散于细胞粘液中。根据现有报道,半夏凝集素也具有抗肿瘤作用,糖基识别作用,免疫应激和免疫刺激作用,等。当前半夏凝集素的研究主要集中在四个方面:1,半夏凝集素的结构,功能,以及提取和分离纯化的方法;2,半夏凝集素的生物反应器高效表达与变构半夏凝集素的表达;3,半夏凝集素的抗肿瘤研究,包括其抗肿瘤机制,抗肿瘤细胞范围,抗肿瘤佐剂效应,抗肿瘤活性等等;4,半夏凝集素的转基因抗虫研究,抗菌研究,以及半夏凝集素的抗虫机制和机理。本实验以组织培养为基础和实验体系,研究半夏在非生物胁迫下的生理周期的改变,包括半夏的倒伏,恢复,块茎的成熟,探讨其潜在的抗逆基因和调控方式;然后分析和克隆了半夏凝集素基因,并参考其保守区域,设计了若干个单点突变和双点突变,估测其凝集糖基的潜...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
缩略语
第一章 引言
    1.1 半夏凝集素的凝集性
        1.1.1 半夏简介
        1.1.2 凝集素发展史
        1.1.3 半夏凝集素发展史
    1.2 半夏凝集素的工业应用
        1.2.1 半夏凝集素的生物反应表达
        1.2.2 半夏凝集素的农业应用
    1.3 半夏凝集素的医学研究进展
        1.3.1 膜电位影响与膜受体
        1.3.2 PTA引起的信号类细胞凋亡
        1.3.3 机体的免疫
        1.3.4 细胞自噬
        1.3.5 医学其他应用
    1.4 研究的目的和意义
第二章 半夏的组织培养与热胁迫后恢复
    2.1 实验材料和试剂
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 试剂和仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 母液配置
        2.2.2 材料处理
        2.2.3 半夏的组织培养
        2.2.4 半夏组培苗的乙烯利处理
        2.2.5 半夏组培苗的高温胁迫处理
        2.2.6 半夏愈伤组织生根培养，苗诱导培养
    2.3 结果与分析
        2.3.1 3.5 mg/L 6-BA+MS培养基培养半夏无菌苗
        2.3.2 不同激素对半夏愈伤组织诱导
        2.3.3 乙烯利处理半夏实验结果
        2.3.4 乙烯利处理半夏组培苗枯萎状况
        2.3.5 乙烯利处理下半夏块茎生长大小
        2.3.6 热胁迫后半夏植株的恢复
        2.3.7 半夏愈伤组织生根培养
    2.4 小结与讨论
第三章 PTA结构与分子研究
    3.1 实验材料与仪器
        3.1.1 实验材料
        3.1.2 实验试剂
        3.1.3 实验仪器
        3.1.4 实验涉及质粒以及质粒图谱
        3.1.5 实验流程图
    3.2 实验方法
        3.2.1 SDS提取DNA
        3.2.2Trizol试液提取RNA
        3.2.3 PCR引物设计
        3.2.4 M-Mu LV法Reverse PCR
        3.2.5 PCR扩增DNA序列
        3.2.6 割胶回收
        3.2.7 E.coli DH5α 感受态细胞制作
        3.2.8 TA克隆
        3.2.9 质粒提取
        3.2.10 双酶切实验
        3.2.11 质粒转化
        3.2.12 p Cambia1303质粒构建
        3.2.13 LBA4404农杆菌感受态细胞制作
        3.2.14 LBA4404农杆菌载体构建
        3.2.15 PTA点突变序列构建
        3.2.16 EGFP-N1载体构建
        3.2.17 PTA环肽结构基因扩增
        3.2.18 PTA的RACE初步探索
        3.2.19 PTA抗性大肠杆菌菌株的紫外诱变
    3.3 结果与分析
        3.3.1 PTA序列分析
        3.3.2 Antheprot Graphic viewer分析PTA信号肽位置
        3.3.3 PTA的序列扩增
        3.3.4 PTA测序结果
        3.3.5 PTA的点突变序列
        3.3.6 酶切实验结果
        3.3.7 菌液PCR
        3.3.8 紫外诱变耐PTA筛选
        3.3.9 PTA分子的单酶切产物
        3.3.10 PTA短肽PCR电泳
        3.3.11 PTA短肽TA克隆菌液PCR
    3.4 结果与讨论
第四章 PTA的浮萍生物表达
    4.1 实验材料与仪器
        4.1.1 实验材料
        4.1.2 实验试剂
        4.1.3 实验仪器
    4.2 实验步骤
        4.2.1 浮萍无菌体系
        4.2.2 浮萍祛藻纯化培养
        4.2.3 浮萍的无菌培养
        4.2.4 农杆菌转化实验
        4.2.5 浮萍中转基因成分的鉴定
    4.3 实验结果与分析
        4.3.1 浮萍的去藻化培养
        4.3.2 浮萍转化培养
        4.3.3 浮萍最终生长状态
        4.3.4 转基因浮萍一次筛选后PCR鉴定
        4.3.5 转基因浮萍二次筛选后PCR鉴定
    4.4 结果与讨论
结论
参考文献
成果
致谢



本文编号：4044591