拟穴青蟹mih基因和chh基因启动子的功能分析

发布时间：2020-04-15 13:45

【摘要】：甲壳动物高血糖激素家族在调控甲壳动物的变态发育、生殖、蜕皮、血糖平衡及体内的渗透压平衡等方面起着重要的作用,甲壳动物高糖激素(Crustacean hyperglycemic hormone,CHH)和蜕皮抑制激素(Molt-inhibiting hormone,MIH)是甲壳动物高血糖激素家族中的两个重要成员。本研究通过Genome walking和Tail-PCR方法克隆获得了拟穴青蟹mih基因和chh基因的5’侧翼区序列,然后对获得的序列进行生物信息学分析,再通过构建重组质粒、瞬时转染和双荧光素酶报告基因检测系统对mih基因和chh基因的启动子做了功能分析。主要研究结果如下:1)目前通过Genome walking和Tail-PCR方法克隆获得的mih基因的5’侧翼区序列,从翻译起始位点(ATG)起共2024 bp。生物信息学分析结果显示,转录起始位点是位于ATG上游的第207个碱基“A”,在转录起始位点(A)上游33 bp处有一个TATA box;潜在的转录因子结合位点包括Ap-1、Sp1、NF-1、Oct-1、RAP1、Sox-2、C/EBPalp、NF-κappaB、GATA-1等;有两个CpG岛,分别位于-25 bp—+183 bp及-1451 bp—-1316 bp。2)目前通过Genome walking和Tail-PCR方法克隆获得的chh基因的5’侧翼区序列,从翻译起始位点(ATG)起共657 bp。生物信息学分析结果显示,转录起始位点是位于ATG上游的第74个碱基“A”,在转录起始位点(A)上游31 bp处有一个TATA box;潜在的转录因子结合位点包括Oct-1、C/EBPalp、GATA-1、Sp1、Ap-1、NF-κappaB、NF-1、RAP1、HNF-3等;没有CpG岛。3)mih基因启动子不同长度片段在HEK293T细胞和Sf9细胞中的活性分析结果显示,在-1350 bp—-889 bp之间、-308 bp—-26 bp之间都存在重要的调控序列。对-1350 bp—-889bp之间预测的转录因子NF-κB结合位点进行位点突变和活性分析,发现NF-κB在调控mih基因的表达过程中可能起促进作用。对-308 bp—-26 bp之间预测的转录因子RAP1结合位点进行位点缺失和活性分析,发现RAP1可能正调控mih基因的表达。4)在研究mih基因启动子区微卫星序列(CA)n多态性对启动子活性的影响中发现,含CA(n=11)的片段的活性最高,含CA(n=10)的片段的活性高于含CA(n=12)的片段。5)chh基因启动子不同长度片段在HEK293T细胞和Sf9细胞中的活性分析结果显示,在-286 bp—-46 bp、-583 bp—-388 bp区域可能存在负调控基因表达的转录因子结合位点,在-388 bp—-286 bp区域可能存在正调控基因表达的转录因子结合位点。
【图文】：

大学硕士学位论文 拟穴青蟹mih基因和chh基因启动子的功是热稳定的肽类物质，有许多生化性质方面的相似处。由于 CHH 家族神经肽成上相似，且在功能上有多样性，所以推测多种神经肽激素综合调控着甲壳动物的育[11-13]。CHH 家族在调控甲壳动物一系列重要的生理活动中起着关键作用，如能蜕皮、血糖平衡、性成熟以及对环境的适应代谢等（图 1-1），，因此一直是神经内研究热点[14]。

可以使某些基因特异性表达或抑制，控制特定基因在细胞内的表达水平，从而调节细胞生长、分化和发育等[53,54]。因此对基因启动子进行功能分析对于揭示转录调控的分子机制具有重要意义。1.5.1 真核生物启动子的结构启动子是结构基因的重要组成部分，调控着基因的表达。然而启动子本身并不能调控基因的转录，而是通过与相应的反式作用元件（转录因子）结合，并在 RNA 聚合酶的作用下才能启动对基因的表达调控。RNA 聚合酶可分为 3 类，真核生物的启动子为 RNA 聚合酶 II 型启动子，这类启动子主要涉及编码蛋白质基因的表达调控[55]。一般来说，启动子是由一个核心启动子区和一个调控区组成的。核心启动子区大约100bp 左右，一般位于转录起始点附近，主要包含起始子（Initiator，Inr）、TATA 盒、TFII特异性识别元件（TFIIB recognition element，BRE）、下游启动子元件（Downstream promotelement，DPE）及十基序元件（Motif- ten element，MTE），整合了所有参与促进转录或抑制转录的调控因子（图 1-2）[56-59]。有一种启动子是由 CpG 岛构成而并不含有 TATAboxCpG 岛在基因表达的调控和细胞分化过程中发挥关键作用[60]。
【学位授予单位】：集美大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4

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