赤眼鳟Toll样受体7和9基因的克隆与表达

发布时间：2020-05-03 17:41

【摘要】：赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)俗称野草鱼,与草鱼同属雅罗鱼亚科,属于赤眼鳟属。赤眼鳟具有比草鱼更好的抗草鱼呼肠弧病毒(Grass carp reovirus,GCRV)入侵的特性,Toll样受体(Toll Like Receptors,TLRs)是鱼类先天性免疫反应中最重要的模式识别受体家族(Pattern recognition receptors,PRRs)。Toll样受体7(TLR7)和Toll样受体9(TLR9)基因是TLR7亚家族的主要成员,在抗病毒免疫反应中扮演着重要的角色。(1)通过RACE-PCR技术,克隆了赤眼鳟TLR7基因(ScTLR7)cDNA全长序列,利用生物信息学方法分析其结构特性,采用Real Time qPCR技术比较分析了ScTLR7免疫应答GCRV的表达特性。结果表明,ScTLR7基因cDNA全长3715 bp,包括开放阅读框(ORF)3162 bp,编码1053个氨基酸残基,5′-非编码区(UTR)403 bp和3′-UTR150 bp(GenBank登录号为KY472228)。推导的蛋白质相对分子量为121.70 kD,理论等电点为7.88。通过I-TASSER预测赤眼鳟TLR7蛋白的三级结构显示,ScTLR7蛋白为典型的马蹄形结构,包括28个α螺旋和26个β折叠。SMART结构域预测结果显示:ScTLR7具有TLRs的典型结构特征,由N端的信号肽、15个富亮氨酸结构域(LRRs)、跨膜结构域(TM)和Toll/白介素-1受体结构域(TIR)组成。TLR7氨基酸的系统进化树显示赤眼鳟TLR7与团头鲂TLR7的亲缘关系最近,不同物种TLR7 TIR结构域氨基酸序列比对结果显示:硬骨鱼类TLR7基因的TIR结构域氨基酸序列高度保守,但没有发现3个与配体接头TIR结构域中的3个保守盒子Box1、Box2和Box3。TLR7在赤眼鳟检测的9个组织中均有表达,其中TLR7在赤眼鳟头肾、脾脏中的表达量最高,GCRV感染后,TLR7在赤眼鳟、草鱼头肾中不同时间表达水平结果表明,感染GCRV后TLR7在草鱼和赤眼鳟头肾中的表达模式类似,ScTLR7和CiTLR7的相对表达量都在96 h达到峰值。(2)通过RACE-PCR技术,克隆了赤眼鳟TLR9基因(ScTLR9)cDNA全长序列,利用生物信息学方法分析其结构特性,采用Real Time qPCR技术比较分析了ScTLR9免疫应答GCRV的表达特性。结果表明:赤眼鳟TLR9基因cDNA全长3687 bp,包括开放阅读框(ORF)3180 bp,编码1059个氨基酸残基,5′-非编码区(UTR)128 bp和3′-UTR 379 bp(GenBank登录号为KU955845)。推导的蛋白质相对分子量为121.61 kD,理论等电点为8.91。通过I-TASSER预测赤眼鳟TLR9蛋白的三级结构显示,ScTLR9蛋白为典型的马蹄形结构,包括22个α螺旋、12个β折叠。SMART结构域预测结果显示:ScTLR9由N端的信号肽、16个富亮氨酸结构域(LRRs)、跨膜结构域(TM)和Toll/白介素-1受体结构域(TIR)组成,具有TLRs的典型结构特征。不同物种TLR9氨基酸的系统进化树显示赤眼鳟TLR9与草鱼TLR9的亲缘关系最近,不同物种TLR9 TIR结构域氨基酸序列比对结果显示:硬骨鱼类TLR9基因的TIR结构域氨基酸序列高度保守,同时ScTLR9的TIR结构域包含三个高度保守的区域:Box 1(YDAFVVFD)、Box2(LCLEDRDWLPG)和Box 3(FWNNL)。TLR9在赤眼鳟检测的10个组织中均有表达,其中TLR9在赤眼鳟头肾、中肾中的表达量最高,GCRV感染后,TLR9在赤眼鳟、草鱼头肾中不同时间表达水平结果表明,感染GCRV后TLR9在草鱼和赤眼鳟头肾中的表达模式表现出明显的差异,在应对GCRV时,ScTLR9比CiTLR9的应答时间更短,反应更迅猛,且ScTLR9的相对表达量率先达到峰值,整体相对表达量远远高于草鱼。(3)通过构建赤眼鳟Toll样受体9基因的原核表达载体,命名为pET-30a(+)TLR9,分别转化到BL21(DE3)、Rosetta、BL21(DE3)plysS三种宿主菌中进行蛋白表达,经过筛选发现BL21(DE3)plysS为最适蛋白表达宿主菌;通过IPTG诱导表达,得到了TLR9的融合蛋白,经过诱导表达条件的优化,确定最佳诱导条件为0.25mM IPTG,4h,BL21(DE3)plysS;通过对重组融合蛋白的可溶性分析,结果表明目的蛋白是可溶性的。经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定表明ScTLR9蛋白大小约为82 kD,与预期结果相符。以上结果为深入研究赤眼鳟Toll样受体9基因的功能奠定了基础。
【图文】：

通过普通 PCR 获得了单一产物（1kb~1.5kbp）（图2-1：Ⅰ）；以 TLR75′ RACE 为引物，按照 SMARTer RACE 的说明通过 RACE PCR 获得了目的产物（2.0k～2.5kbp）（图 2-1：Ⅱ）；以 TLR73′ RACE 为引物，按照 SMARTer

14图 2-2 ScTLR7cDNA 氨基酸(aa)序列预测结果Fig.2-2 ScTLR7 cDNA amino acid (aa) sequence prediction results开放阅读框(ORF)区域的核酸序列为大写字母，5′/3′端非编码区(UTR)核酸序列为小写字母。起始密码子(ATG)和终止密码子(TGA)分别用方框标记和星号标记。在所预测的氨基酸序列中，信号肽序列(1-23 aa)用波浪线标记；富亮氨酸结构域(32-66 aa，123-146 aa，200-223 aa，221-240 aa，286-309 aa，336-356 aa，，393-413 aa，521-545 aa，546-572 aa，600-628 aa，654-677 aa，679-695 aa，703-722 aa，751-772 aa，777-800 aa) 、C-端富亮氨酸结构域(788-839 aa)和 Toll/白介素-1 受体结构域(895-1041 aa)用单下划线标记；。mRNA 不稳定信号“attta”和多聚腺苷酸加尾信号“aataaa”用双下划线标记The ORF region within the nucleotide sequence was shown in upper cases whereas the5′/3′UTR regions were shown in lower cases.The start codon (ATG) was boxed and the stop
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4

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