团头鲂β-防御素1对巨噬细胞趋化效应研究

发布时间：2020-05-03 19:16

【摘要】：β-防御素(β-defensin,BD)是一种富含半胱氨酸具有广谱抗菌活性的阳离子短肽。目前研究发现,BD可以趋化免疫细胞迁移,在机体免疫调节中发挥重要作用。本研究通过对团头鲂β-防御素1(MaBD1)进行表达和纯化,获得团头鲂β-防御素1重组蛋白,研究其对团头鲂白细胞,尤其是巨噬细胞的趋化作用和炎症细胞因子表达的影响。实验结果如下:1.构建原核重组表达载体pET-32a-MaBD1,通过IPTG诱导表达MaBD1重组融合蛋白。将该蛋白利用Ni~(2+)亲和层析方法纯化后,再经肠激酶酶切及纯化,获得MaBD1重组蛋白。使用MaBD1重组蛋白进行抑菌实验,结果显示MaBD1重组蛋白对大肠杆菌、嗜水气单胞菌和金黄色葡萄球菌具有明显的抑菌活性。2.采用Percoll非连续梯度离心法分离团头鲂头肾白细胞,再利用贴壁方法分离纯化巨噬细胞,采用光镜和透射电子显微镜进行鉴定,结果显示:团头鲂头肾白细胞主要包括:中性粒细胞、单核/巨噬细胞和淋巴细胞。贴壁巨噬细胞铺展或伸长呈各种形状,细胞核圆形和椭圆形,多数偏于细胞一侧。巨噬细胞表面标志CD68在贴壁巨噬细胞中高表达。3.用Transwell法检测MaBD1的体外趋化活性,发现MaBD1重组蛋白对白细胞,尤其是巨噬细胞具有明显趋化作用。为进一步了解MaBD1趋化功能位点,分别合成N端(MaBDP1)和C端(MaBDP2)MaBD1多肽,N端的趋化活性显著高于C端。4.将MaBDP1注射团头鲂腹腔,观察MaBDP1对体内白细胞以及巨噬细胞趋化活性,结果显示MaBDP1对体内白细胞和巨噬细胞都有趋化作用。在2 d500 ng/mL MaBDP1对白细胞具有趋化作用。而在3 d 1000 ng/mL MaBDP1对巨噬细胞趋化作用明显。qPCR检测MaBDP1对促炎细胞因子(IL-1β和TNF-α)表达影响结果显示:脾脏,头肾和体肾中IL-1β表达量在6 h和72 h表达量显著升高,肝胰腺中IL-1β表达量在6 h表达量显著升高;脾脏,头肾和体肾中TNF-α表达量在72 h显著升高,肝胰腺中TNF-α表达量在6 h显著升高。表明MaBDP1可以促进IL-1β和TNF-α的表达,增强机体的炎症反应。
【图文】：

方式,半胱氨酸,人类首次,天然免疫

在先天免疫发挥重要作用。防御素研究进展.1 防御素概述防御素（defensins）是物种进化中保留的有效天然免疫因子，它是一种分布于动植物界的富含半胱氨酸具有广谱抗菌活性的阳离子短肽（Mak et996）。防御素包括 6-8 个保守的半胱氨酸，根据二硫键的连接方式可以将防可分为α-防御素、β-防御素和θ-防御素三类（图 1-1）。防御素几乎广泛分布有的生物体中。人类首次从古比天蚕蛹中得到防御素（Hultmark et al 1980）类最早在斑马鱼中发现防御素（Zou et al 2007）。在哺乳动物中，，首次在兔细胞中发现（Ganz et al 1985）。

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图 1-2：趋化过程示意图1.2 鱼类β-防御素研究进展目前在草鱼、团头鲂、虹鳟、青溕、斑马鱼等鱼类中均发现β-防御素（玉婷 2012, 张涓 2014, Zou et al 2007, Falco et al 2008, Zhao et al 2009）。这些防御素成熟肽一般由 39~45 个氨基酸残基组成（郭洪燕 2012）。在鱼类中，防御素在不同物种中表达有所差异，如斑马鱼β-防御素在皮肤、性腺、肠、脾、肝和肠中均有表达（Zou et al 2007），青溕的β-防御素主要表达在眼睛（Zhao et al 2009），而石斑鱼的β-防御素只在垂体和精巢中表达，这可能和内泌调节有关（Jin et al 2010）。β-防御素在不同组织中表达，说明β-防御素生物功能具有多样性。另外，鱼类β-防御素在分子特征、基因结构上和哺乳类β御素也有很大的不同（郭洪燕 2012, Zou et al 2007, Zhao et al 2009），如鱼类
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S943

【参考文献】