赭曲霉P450单加氧酶的定点改造及功能分析

发布时间：2025-07-02 00:03

　　11α-羟基坎利酮是合成对心血管具有保护作用的依普利酮的医药中间体,是制备依普利酮的关键步骤。本实验室分离获得的一株赭曲霉MF016菌株中存在细胞色素P450(CYP)酶系统,可转化坎利酮生成11α-羟基坎利酮,但转化率较低。且该酶菌产生的次级代谢产物——赭曲霉毒素(OTA)具有强烈的肝脏和肾脏毒性以及潜在的致癌和突变能力,严重制约了其在制药和食品等相关领域的应用。提高赭曲霉对甾体类药物的催化效率一般需从发酵条件优化和菌株改造两个方面进行。目前,有关赭曲霉催化甾体类药物发酵条件优化的研究已有不少,但对赭曲霉菌株的定向改造报道不多见,而后者才是提高甾体催化效率的关键和技术难点。为了获得一株高表达CYP单加氧酶而又失去产OTA能力的赭曲霉基因工程菌株,本研究利用测序平台Pac Bio SMRT对赭曲霉MF016进行全基因组测序与注释,获得赭曲霉菌株MF016全基因组信息(Gen Bank No.VBTP00000000)。根据已报道的两个与OTA合成相关的聚酮合酶基因(pks)序列信息,预测了赭曲霉MF016的两个聚酮合酶基因pks1和pks2,并选择pks2为待敲除基因。根据pks2序列设...

【文章页数】：102 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图5.2 cypm的PCR产物电泳图

将经PCR验证正确的菌株测序。测序结果经Blast+分析显示,与预测的cypm基因同源性为99.9%,序列大小为1834bp,共包含四个内含子,编码序列长1542bp,序列详情见附录6。综上,成功获得cypm基因并构建了质粒pMD18-Cyp。5.3.2cypm上游同源臂....

图5.3 Up的PCR产物电泳图

将PCR验证正确的转化子进行测序分析,结果显示,与预测的序列同源性为99.9%,序列大小为1011bp,序列详情见附录7。综上,成功获得Up序列片段并构建了质粒pMD18-Up。5.3.3cypm下游同源臂序列的克隆及质粒pMD18-Down的构建

图5.4 Down的PCR产物电泳图

将PCR验证正确的转化子测序分析,结果显示,与预测的序列同源性为99.9%,序列大小为610bp,序列详情见附录8。综上,成功获得Down序列片段并构建了质粒pMD18-Down。5.3.4Tr启动子的克隆及质粒pMD18-Tr的构建

图5.5 Tr启动子的PCR产物电泳图

将阳性转化子测序分析,结果显示,序列大小为359bp,与预测的序列同源性为99.8%,序列详情见附录9。综上,成功获得Tr启动子并构建了质粒pMD18-Tr。5.3.5hyg基因的克隆及质粒pMD18-Hyg的构建

本文编号：4054905