基于纳米抗体检测赭曲霉毒素A的酶免疫传感方法构建及抗体定向进化研究
发布时间：2025-05-07 20:33
赭曲霉毒素A（Ochratoxin A,OTA）主要是由曲霉和青霉产生的次级代谢产物,主要污染粮谷类、咖啡、中草药、葡萄及葡萄酒等农作物及食品。研究表明,OTA对人类及动物都具有肝肾毒性、致癌和致突变等作用,是目前对人类及动物最具威胁的真菌毒素之一。因此,对OTA建立高灵敏度、快速简便的检测方法意义重大。本研究从两个方向着手,致力于提高检测方法的灵敏度。一是结合新型信号放大方式构建检测OTA的酶促免疫传感方法;二是对抗OTA纳米抗体进行体外亲和成熟,提高纳米抗体的亲和力。主要研究如下:1. 钙黄绿素可与Ce3+结合形成络合物,其荧光发生猝灭;当Ce3+与PO43-结合产生Ce PO4时,钙黄绿素从络合物中解离,其荧光发生复性。利用钙黄绿素与PO43-竞争结合Ce3+的原理,构建磷酸盐触发荧光免疫传感系统。通过优化免疫传感系统中各参数,如抗原浓度、抗体浓度、甲醇浓度、竞争反应时间、p H值和离子强度,建立了基于纳米抗...
【文章页数】：90 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 引言
1.1 OTA的研究进展
1.1.1 OTA的结构及其理化性质
1.1.2 OTA的毒性作用和限量标准
1.1.3 OTA的检测方法
1.2 纳米抗体的研究进展
1.2.1 纳米抗体的来源
1.2.2 纳米抗体的特性
1.2.3 纳米抗体在分析检测中的应用
1.3 基因工程抗体体外亲和成熟的研究进展
1.3.1 抗体库展示技术
1.3.2 基因工程抗体体外亲和成熟方法
1.4 论文研究的目的意义和内容
1.4.1 本文研究的主要内容
1.4.2 本文研究的目的及意义
1.4.3 创新点
2 基于Nb-AP检测赭曲霉毒素A的磷酸盐触发荧光免疫分析法
2.1 材料、仪器与试剂
2.1.1 主要材料
2.1.2 主要试剂及培养基
2.1.3 主要仪器与设备
2.2 方法与步骤
2.2.1 Nb28-AP的诱导表达、纯化及鉴定
2.2.2 Nb-AP介导的磷酸盐触发荧光免疫分析法的构建
2.2.3 Nb28-AP介导的磷酸盐触发荧光免疫分析法的构建
2.3 结果与讨论
2.3.1 Nb28-AP的诱导表达、纯化及鉴定
2.3.2 磷酸盐触发荧光传感系统的构建
2.3.3 Nb-AP介导的磷酸盐触发荧光免疫分析法(PT-FIA)的构建
2.4 小结
3 纳米抗体Nb28的分子模拟及丙氨酸扫描
3.1 材料、仪器与试剂
3.1.1 主要材料
3.1.2 主要试剂
3.1.3 主要仪器与设备
3.1.4 丙氨酸扫描突变引物
3.2 方法与步骤
3.2.1 SWISS-MODEL建模
3.2.2 Nb28与OTA分子对接
3.2.3 丙氨酸扫描突变
3.2.4 突变子的表达与纯化
3.2.5 突变子的活性分析
3.3 结果与讨论
3.3.1 SWISS-MODEL建模
3.3.2 Nb28与Nb28与OTA的分子对接
3.3.3 丙氨酸扫描突变
3.3.4 突变子的活性分析
3.4 小结
4 纳米抗体Nb28体外亲和成熟
4.1 材料、仪器与试剂
4.1.1 主要材料
4.1.2 主要试剂及培养基
4.1.3 主要仪器与设备
4.1.4 突变引物
4.2 方法与步骤
4.2.1 pHEN1-28的双位点随机突变
4.2.2 随机突变文库的构建
4.2.3 饱和突变文库的救援
4.2.4 抗OTA纳米抗体的淘选
4.2.5 突变子活性分析
4.2.6 表达载体构建
4.2.7 Nb-G53Q&S102D的表达及活性分析
4.2.8 Nb-G53Q&S102D亲和力测定
4.3 结果与讨论
4.3.1 pHEN1-28的双位点随机突变
4.3.2 文库的质量评估
4.3.3 抗OTA纳米抗体的淘选与鉴定
4.3.4 突变子活性分析
4.3.5 Nb-G53Q&S102D的活性分析
4.3.6 Nb-G53Q&S102D亲和力测定
4.4 小结
5 结论
参考文献
附录 硕士期间发表论文
致谢
本文编号：4043759
【文章页数】：90 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 引言
1.1 OTA的研究进展
1.1.1 OTA的结构及其理化性质
1.1.2 OTA的毒性作用和限量标准
1.1.3 OTA的检测方法
1.2 纳米抗体的研究进展
1.2.1 纳米抗体的来源
1.2.2 纳米抗体的特性
1.2.3 纳米抗体在分析检测中的应用
1.3 基因工程抗体体外亲和成熟的研究进展
1.3.1 抗体库展示技术
1.3.2 基因工程抗体体外亲和成熟方法
1.4 论文研究的目的意义和内容
1.4.1 本文研究的主要内容
1.4.2 本文研究的目的及意义
1.4.3 创新点
2 基于Nb-AP检测赭曲霉毒素A的磷酸盐触发荧光免疫分析法
2.1 材料、仪器与试剂
2.1.1 主要材料
2.1.2 主要试剂及培养基
2.1.3 主要仪器与设备
2.2 方法与步骤
2.2.1 Nb28-AP的诱导表达、纯化及鉴定
2.2.2 Nb-AP介导的磷酸盐触发荧光免疫分析法的构建
2.2.3 Nb28-AP介导的磷酸盐触发荧光免疫分析法的构建
2.3 结果与讨论
2.3.1 Nb28-AP的诱导表达、纯化及鉴定
2.3.2 磷酸盐触发荧光传感系统的构建
2.3.3 Nb-AP介导的磷酸盐触发荧光免疫分析法(PT-FIA)的构建
2.4 小结
3 纳米抗体Nb28的分子模拟及丙氨酸扫描
3.1 材料、仪器与试剂
3.1.1 主要材料
3.1.2 主要试剂
3.1.3 主要仪器与设备
3.1.4 丙氨酸扫描突变引物
3.2 方法与步骤
3.2.1 SWISS-MODEL建模
3.2.2 Nb28与OTA分子对接
3.2.3 丙氨酸扫描突变
3.2.4 突变子的表达与纯化
3.2.5 突变子的活性分析
3.3 结果与讨论
3.3.1 SWISS-MODEL建模
3.3.2 Nb28与Nb28与OTA的分子对接
3.3.3 丙氨酸扫描突变
3.3.4 突变子的活性分析
3.4 小结
4 纳米抗体Nb28体外亲和成熟
4.1 材料、仪器与试剂
4.1.1 主要材料
4.1.2 主要试剂及培养基
4.1.3 主要仪器与设备
4.1.4 突变引物
4.2 方法与步骤
4.2.1 pHEN1-28的双位点随机突变
4.2.2 随机突变文库的构建
4.2.3 饱和突变文库的救援
4.2.4 抗OTA纳米抗体的淘选
4.2.5 突变子活性分析
4.2.6 表达载体构建
4.2.7 Nb-G53Q&S102D的表达及活性分析
4.2.8 Nb-G53Q&S102D亲和力测定
4.3 结果与讨论
4.3.1 pHEN1-28的双位点随机突变
4.3.2 文库的质量评估
4.3.3 抗OTA纳米抗体的淘选与鉴定
4.3.4 突变子活性分析
4.3.5 Nb-G53Q&S102D的活性分析
4.3.6 Nb-G53Q&S102D亲和力测定
4.4 小结
5 结论
参考文献
附录 硕士期间发表论文
致谢
本文编号：4043759
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/qgylw/4043759.html
