人溶菌酶在毕赤酵母中分泌表达的研究
发布时间：2025-05-11 03:21
溶菌酶能够水解细菌细胞壁中β-1,4糖苷键,破坏细胞壁肽聚糖结构,是一种安全性高的药品、饲料食品添加剂。市场上销售的溶菌酶主要是从鸡蛋清中提取。相比于鸡溶菌酶,人溶菌酶(Human lysozyme,hLYZ)具有生物活性高、稳定性好,具有较高的应用价值。受限于原料来源、提纯精制成本等因素,人源溶菌酶制备量较少,不能满足需求。本论文通过共表达分子伴侣Kar2p、ERO1p、转录因子Hac1p及优化基因剂量,研究其对毕赤酵母KM71菌株表达人溶菌酶水平的影响,期望得到高效表达人溶菌酶的毕赤酵母基因工程菌株。(1)根据GenBank中Kar2p、ERO1p和Hac1p基因序列,设计引物,构建重组载体pG418-Kar2p、pG418-ERO1p和p9K-Hac1p。采用电击转化法,将构建的重组载体整合于含人溶菌酶基因的重组酵母菌株KM71-pPIC-hLYZ-3基因组中,在含G418的YPDS平板上筛选得到共表达分子伴侣Kar2p、ERO1p和人溶菌酶的工程菌株 KM71-pPIC-hLYZ-Kar2p-5、KM71-pPIC-hLYZ-ERO1p-7,以及共表达转录因子Hac1p和人溶菌酶...
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
1 绪论
1.1 溶菌酶概述
1.1.1 溶菌酶
1.1.2 溶菌酶应用
1.1.3 人源溶菌酶研究意义及现状
1.2 毕赤酵母表达系统
1.2.1 毕赤酵母表达载体
1.2.2 毕赤酵母表达宿主菌
1.2.3 提高毕赤酵母表达外源蛋白的策略
1.3 本课题研究研究内容
2 共表达Kar2p、ERO1p和Hac1p对hLYZ表达的影响
2.1 材料
2.1.1 菌株及质粒
2.1.2 引物
2.1.3 试剂及主要仪器
2.1.4 培养基及试剂配制
2.2 方法
2.2.1 质粒提取
2.2.2 PCR产物纯化
2.2.3 酶切DNA片段回收
2.2.4 酵母基因组提取
2.2.5 大肠杆菌DH5a感受态制备及转化
2.2.6 共表达分子伴侣Kar2p、ERO1p重组载体的构建及鉴定
2.2.7 共表达转录因子Hac1p重组载体的构建及鉴定
2.2.8 工程菌株构建
2.2.9 共表达Kar2p、ERO1p和Hac1p的工程菌株摇瓶发酵
2.2.10 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
2.2.11 重组菌株生长曲线、胞外蛋白量及人溶菌酶活力的测定
2.3 结果与讨论
2.3.1 重组载体的构建及鉴定
2.3.2 共表达Kar2p、ERO1p及Hac1p的重组菌株构建
2.3.3 共表达Kar2p、ERO1p和Hac1p对hLYZ表达的影响
2.3.4 讨论
2.4 本章小结
3 基因剂量对hLYZ表达的影响
3.1 材料
3.1.1 菌株及质粒
3.1.2 引物
3.1.3 试剂及主要仪器
3.1.4 培养基及试剂
3.2 方法
3.2.1 多拷贝串联载体的构建及鉴定
3.2.2 工程菌株构建
3.2.3 定量PCR鉴定工程菌株hly基因拷贝数
3.2.4 工程菌株摇瓶发酵
3.2.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
3.2.6 重组菌株生长曲线、胞外蛋白量及人溶菌酶活力的测定
3.3 结果与讨论
3.3.1 多拷贝串联载体的构建及鉴定
3.3.2 携带不同hly基因拷贝数的工程菌株构建
3.3.3 定量PCR鉴定工程菌株hly基因拷贝数
3.3.4 基因剂量对hLYZ表达的影响
3.3.5 讨论
3.4 本章小结
4 共表达Hac1p对hLYZ表达的影响
4.1 材料
4.1.1 菌株及质粒
4.1.2 引物
4.1.3 试剂及主要仪器
4.1.4 培养基及试剂
4.2 方法
4.2.1 工程菌株构建
4.2.2 共表达Hac1p的工程菌株摇瓶发酵
4.2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
4.2.4 重组菌株生长曲线、胞外蛋白量及人溶菌酶活力的测定
4.3 结果与讨论
4.3.1 工程菌株构建
4.3.2 共表达Hac1p对hLYZ表达的影响
4.3.3 讨论
4.4 本章小结
5 结论与展望
5.1 结论
5.2 展望
参考文献
致谢
攻读学位期间的研究成果
本文编号：4044768
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
1 绪论
1.1 溶菌酶概述
1.1.1 溶菌酶
1.1.2 溶菌酶应用
1.1.3 人源溶菌酶研究意义及现状
1.2 毕赤酵母表达系统
1.2.1 毕赤酵母表达载体
1.2.2 毕赤酵母表达宿主菌
1.2.3 提高毕赤酵母表达外源蛋白的策略
1.3 本课题研究研究内容
2 共表达Kar2p、ERO1p和Hac1p对hLYZ表达的影响
2.1 材料
2.1.1 菌株及质粒
2.1.2 引物
2.1.3 试剂及主要仪器
2.1.4 培养基及试剂配制
2.2 方法
2.2.1 质粒提取
2.2.2 PCR产物纯化
2.2.3 酶切DNA片段回收
2.2.4 酵母基因组提取
2.2.5 大肠杆菌DH5a感受态制备及转化
2.2.6 共表达分子伴侣Kar2p、ERO1p重组载体的构建及鉴定
2.2.7 共表达转录因子Hac1p重组载体的构建及鉴定
2.2.8 工程菌株构建
2.2.9 共表达Kar2p、ERO1p和Hac1p的工程菌株摇瓶发酵
2.2.10 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
2.2.11 重组菌株生长曲线、胞外蛋白量及人溶菌酶活力的测定
2.3 结果与讨论
2.3.1 重组载体的构建及鉴定
2.3.2 共表达Kar2p、ERO1p及Hac1p的重组菌株构建
2.3.3 共表达Kar2p、ERO1p和Hac1p对hLYZ表达的影响
2.3.4 讨论
2.4 本章小结
3 基因剂量对hLYZ表达的影响
3.1 材料
3.1.1 菌株及质粒
3.1.2 引物
3.1.3 试剂及主要仪器
3.1.4 培养基及试剂
3.2 方法
3.2.1 多拷贝串联载体的构建及鉴定
3.2.2 工程菌株构建
3.2.3 定量PCR鉴定工程菌株hly基因拷贝数
3.2.4 工程菌株摇瓶发酵
3.2.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
3.2.6 重组菌株生长曲线、胞外蛋白量及人溶菌酶活力的测定
3.3 结果与讨论
3.3.1 多拷贝串联载体的构建及鉴定
3.3.2 携带不同hly基因拷贝数的工程菌株构建
3.3.3 定量PCR鉴定工程菌株hly基因拷贝数
3.3.4 基因剂量对hLYZ表达的影响
3.3.5 讨论
3.4 本章小结
4 共表达Hac1p对hLYZ表达的影响
4.1 材料
4.1.1 菌株及质粒
4.1.2 引物
4.1.3 试剂及主要仪器
4.1.4 培养基及试剂
4.2 方法
4.2.1 工程菌株构建
4.2.2 共表达Hac1p的工程菌株摇瓶发酵
4.2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
4.2.4 重组菌株生长曲线、胞外蛋白量及人溶菌酶活力的测定
4.3 结果与讨论
4.3.1 工程菌株构建
4.3.2 共表达Hac1p对hLYZ表达的影响
4.3.3 讨论
4.4 本章小结
5 结论与展望
5.1 结论
5.2 展望
参考文献
致谢
攻读学位期间的研究成果
本文编号：4044768
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/4044768.html
