通过阵列式标签高通量测序高效鉴定点突变单克隆细胞

发布时间：2025-06-23 22:25

　　 目的建立阵列式标签标记的高通量测序方法并结合多克隆预筛选实现对点突变单克隆细胞株的高效鉴定。方法通过CRISPR/Cas9介导的同源重组修复(HDR)在K562细胞的rs826415位点引入G到T点突变。侯选细胞按每孔10～20个的密度接种培养多克隆,以带有标签(barcode)的引物区分各多克隆细胞,PCR扩增含rs826415位点的区段,产物合并进行二代测序。生物信息学分析各多克隆细胞的同源重组率及插入/缺失率。将阳性率最高孔内的细胞进一步单克隆培养并鉴定基因型。结果通过CRISPR/Cas9同源重组法和有限稀释获得96个rs826415位点打靶的多克隆细胞。经阵列式标签高通量测序法分析各孔细胞同源重组且不伴随插入/缺失(HDR without indel)的比率,96个多克隆的平均阳性率为0.21%,最高达4.35%,将该多克隆细胞进一步单克隆培养,从30个单克隆中成功获得rs826415位点由G/G突变为T/G的杂合型细胞株。结论通过阵列式标签高通量测序策略结合多克隆细胞预筛选,实现了定点突变单克隆细胞株的高效鉴定,相比常规方法显著降低了工作量和成本。

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【部分图文】：

图2 阵列式标签PCR扩增法构建rs826415位点打靶的多克隆K562细胞二代测序文库

图1利用CRISPR/Cas9介导的同源重组在K562rs826415位点引入G到T点突变2.5单克隆突变细胞的筛选鉴定

图3 二代测序分析筛选阳性率最高的rs826415位点打靶K562细胞多克隆

CRIPSR/Cas9系统为基因编辑提供了有效的工具,但其介导同源重组获得精确编辑的点突变细胞效率仍然偏低,相对早期胚胎和干细胞来说,体细胞中的编辑效率更低,常在1%以下[3],因而需要筛选大量细胞以获得阳性克隆。筛选过程中由于转染和流式分选等引起细胞损伤、单细胞不易增殖及流式分....

图4 Sanger测序鉴定rs826415位点成功G到T点突变的K562单克隆细胞株

目前本研究只获得了杂合型的定点突变克隆,为提高精确基因编辑的纯合型细胞得率可采取添加非同源末端连接(non-homologousendjoining,NHEJ)抑制剂,使用Cas9的不同变体[2]、CRISPR核糖核蛋白[CRISPRribonucleoprotein(R....

图1 利用CRISPR/Cas9介导的同源重组在K562 rs826415位点引入G到T点突变

阵列式标签PCR扩增的混合文库首先通过Agilent2100Bioanalyzer进行质量控制检查,检测结果显示文库主带在431bp左右,产物大小合适,没有小片段污染,说明文库建库质量合格(图3A),双端测序(2×150bp)后分析每孔多克隆细胞的同源重组率和插入缺失率。....

本文编号：4052086