HSP90β在脑心肌炎病毒体外感染中的调控作用及机制研究

发布时间：2025-05-29 02:31

　　脑心肌炎病毒(Encephalomy ocarditis virus,EM CV)属小R N A病毒科心病毒属的成员,其宿主谱广泛,可引起人畜急性心肌炎、脑炎、糖尿病、生殖障碍等症状,给国内外养殖业及公共卫生造成巨大的经济损失和危害。近年来针对EMCV的研究愈来愈多,但该病毒的感染机制及致病机理仍不明确。本研究主要基于课题组前期酵母双杂交及病毒覆盖蛋白结合等实验筛选出的能够与病毒蛋白互作的热休克蛋白90β(Heat shock protein 90β,HSP90β)进行深入的探究,以期明确HSP90β在脑心肌炎病毒体外感染中的调控作用及其机制。通过上调或下调细胞中HSP90β的表达后接种EMCV,检测病毒拷贝数及病毒滴度,明确HSP90β对EMCV体外增殖的影响。利用qPCR及WB等实验进一步探索HSP90β对EMCV调控作用的具体机制,研究结果如下:1、上调宿主细胞中HSP90β的表达显著促进EMCV的体外增殖,反之,利用siRNA下调HSP90β的表达显著抑制EMCV的体外增殖,而且HSP90β的抑制剂GA也显著抑制EMCV的体外增殖。2、EMCV结构蛋白VP2与HSP90β共定位且...

【文章页数】：76 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图2-1 HSP90β基因的PCR扩增及重组质粒的双酶切鉴定

以HEK293细胞的cDNA为模板,进行PCR扩增,所得产物经琼脂糖凝胶电泳检测,在2175bp处可见特异性条带,与预期大小相符(图2-1-A)。将构建的pCMV-Myc-HSP90β重组质粒用SalI和NotI限制性内切酶进行双酶切,酶切后产物经琼脂糖凝胶电泳检测,在2....

图2-2上调HSP90β对EMCV体外增殖的影响

在HEK293细胞上转染pCMV-Myc-HSP90β重组质粒,转染36h后进行接毒。收取细胞分别检测HSP90β基因及蛋白的表达情况。结果如下图所示,转染组HSP90β的mRNA及蛋白表达与对照组相比均显著升高(图2-2-A/B)。qPCR检测病毒拷贝数,如图2-2-C图所示,....

图2-3敲低HSP90β对EMCV增殖的影响

上调HSP90β可以显著促进EMCV的体外增殖,为探究清楚下调HSP90β会对EMCV的体外增殖有何影响,因此又使用针对HSP90β的特异性siRNA进行瞬时敲低实验。合成的3条siRNA中siHSP90β-1干扰效果最佳,因此选择它进行后续的干扰实验(图2-3-A)。瞬时敲低....

图2-4抑制剂GA对EMCV增殖的影响

Geldanamycin是常用的一种针对HSP90的特异性抑制剂,通常简称为GA,它主要是通过与HSP90结构中的NTD结构域中的ATP/ADP结合域结合,进而干扰它稳定客户蛋白的能力,即抑制了HSP90的活性。首先检测不同浓度的GA是否对细胞存在毒性作用,发现四个浓度的GA对于....

本文编号：4048583