外源D-果糖促进鲁氏酵母合成呋喃酮碳代谢的分子机制研究

发布时间：2025-05-29 06:50

　　鲁氏酵母(Z.rouxii)是豆酱和酱油酿造体系的优势菌,可以在发酵过程中把糖类物质转化成有机酸、醇和其他风味代谢产物并产生芳香族化合物。其中4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮(HDMF)和4-羟基-2乙基-5甲基-3(2H)-呋喃酮(HEMF)作为鲁氏酵母重要的香气来源,也是酱油和豆酱当中的主要香气物质,但是其代谢机制尚不清楚。前期研究发现,添加D-果糖可促进鲁氏酵母高产呋喃酮,因此明确外源D-果糖调控鲁氏酵母合成HDMF和HEMF的碳代谢机制,有助于为鲁氏酵母生物合成食品呈香化合物细胞工厂创制提供理论依据。本文通过研究鲁氏酵母外源添加D-果糖对HDMF和HEMF生物合成过程中不同发酵时期的基因的表达量、酶调控作用及其代谢物变化,并利用HPLC对HDMF和HEMF进行定量分析,应用酶学方法在蛋白水平进行共同论证,并结合转录组学和代谢组学从分子角度进一步揭示其代谢机制,为呋喃酮的生物合成提供了新的理论基础。研究结果如下:(1)利用Illumina HiSeqTM高通量测序平台对外源添加D-果糖的鲁氏酵母进行转录组测序,分别获得了不同发酵时期的Clean reads,采用HTSe...

【文章页数】：79 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 文献综述
    1.1 鲁氏酵母
        1.1.1 鲁氏酵母的简介
        1.1.2 鲁氏酵母的研究现状
    1.2 呋喃酮的理化性质
        1.2.1 呋喃酮简介
        1.2.2 呋喃酮的研究现状
    1.3 鲁氏酵母的碳代谢研究
        1.3.1 鲁氏酵母胞内EMP碳代谢途径合成HDMF
        1.3.2 鲁氏酵母胞内PP途径合成HEMF
    1.4 pH值对鲁氏酵母的影响
    1.5 微生物多组学技术
        1.5.1 微生物转录组学
        1.5.2 微生物代谢组学
    1.6 本文的研究目的与主要内容
        1.6.1 研究目的与意义
        1.6.2 项目的研究内容
        1.6.3 技术路线
2 材料与方法
    2.1 试验材料
        2.1.1 菌种、培养基和引物
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 仪器和设备
    2.2 试验方法
        2.2.1 鲁氏酵母的培养与活化
        2.2.2 酵母菌活菌数测定方法及细胞干重含量测定
        2.2.3 细胞光密度与pH值测定
        2.2.4 鲁氏酵母转录组文库的构建及测序
        2.2.5 基于RNA-Seq技术的转录组学分析
        2.2.6 总RNA的提取、反转录以及验证
        2.2.7 实时荧光定量PCR验证分析
        2.2.8 呋喃酮合成关键酶的测定
        2.2.9 LC-MS/MS分析
        2.2.10 鲁氏酵母呋喃酮检测
        2.2.11 生物信息学分析
    2.3 数据处理
3 结果与分析
    3.1 D-果糖对鲁氏酵母细胞生长的影响
        3.1.1 添加D-果糖对鲁氏酵母生物量的影响
        3.1.2 添加D-果糖对鲁氏酵母细胞菌数以及OD值的影响
        3.1.3 添加D-果糖对鲁氏酵母菌落生长情况的影响
    3.2 呋喃酮高效液相色谱检测优化
        3.2.1 HDMF检测波长的选择
        3.2.2 色谱柱的选择
        3.2.3 进样量的选择
        3.2.4 洗脱条件的优化
        3.2.5 标准曲线的绘制
    3.3 添加D-果糖对HDMF和 HEMF产量的影响
    3.4 pH值对鲁氏酵母生长情况及产呋喃酮的影响
        3.4.1 添加D-果糖对鲁氏酵母发酵液pH值的影响
        3.4.2 pH值对鲁氏酵母OD值的影响
        3.4.3 pH值对鲁氏酵母产HDMF的影响
    3.5 转录组学分析
        3.5.1 转录组测序及初步分析
        3.5.2 差异表达基因分析
        3.5.3 GO富集分析
        3.5.4 KEGG pathway富集分析
        3.5.5 KEGG途径的DEGs分析
    3.6 RNA样品的制备、处理以及引物验证
        3.6.1 鲁氏酵母RNA提取
        3.6.2 鲁氏酵母反转录c DNA模板PCR验证
        3.6.3 鲁氏酵母碳代谢差异基因溶解曲线
    3.7 呋喃酮合成相关的基因的相对表达情况
        3.7.1 呋喃酮合成相关基因在EMP和 PP途径中的瞬时过表达
        3.7.2 TCA循环中差异基因的瞬时表达
    3.8 EMP和 PP途径关键酶活测定
    3.9 鲁氏酵母代谢产物对比分析
        3.9.1 OPLS-DA分析
        3.9.2 EMP和 PP途径中与呋喃酮合成相关的代谢物
        3.9.3 鲁氏酵母挥发性代谢产物分析
    3.10 鲁氏酵母FBA基因生物信息学分析
        3.10.1 FBA基因的理化性质分析
        3.10.2 FBA的 CpG岛分析
        3.10.3 FBA的蛋白结构预测
4 讨论
    4.1 外源添加D-果糖对鲁氏酵母生长特性的影响
    4.2 pH值对鲁氏酵母产呋喃酮的影响
    4.3 外源添加D-果糖对鲁氏酵母碳代谢的影响
    4.4 FBA基因的生物信息学分析
5 结论
    5.1 结论
    5.2 展望
参考文献
附录
致谢
个人简历



本文编号：4048897