微球型魔芋葡甘聚糖生物材料的结构设计及调控

发布时间：2017-03-21 05:02

  本文关键词：微球型魔芋葡甘聚糖生物材料的结构设计及调控，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：魔芋葡甘聚糖(KGM)是一种水溶性植物多糖,具有良好的生物相容性,具备作为理想生物材料的优良特性。本课题以魔芋粗粉为原料,提取精制出KGM,制备出KGM微球颗粒,建立了完整的制备工艺,用于生物分离介质和细胞培养微载体。采用醇洗的方法制备了纯度在85%以上的KGM精粉,去除了魔芋粗粉中含有的绝大部分可溶性杂质,包括可溶性糖、色素和粗蛋白等。此外,针对KGM水溶液粘度大(2320 mPa.s,1% KGM)、难以分散成球的不足,选用化学降解法,对KGM分子进行了降解,降解后的KGM分子量集中在20 kD-40 kD,粘度下降至200～300 mPa.s(12%KGM)。采用搅拌悬浮法制备了两种不同交联度(25%和50%)的KGM脱盐微球介质,两种微球形貌规整,筛分后的平均粒径为150μm。两种KGM微球对球状蛋白的分离范围分别为1 kD-10 kD和4 kD-30 kD。利用这两种KGM微球介质对蛋白质溶液进行了脱盐,最终获得的蛋白回收率均在95%以上,脱盐效果与商品化葡聚糖介质相当。经测定,KGM微球介质具有优良的物理化学稳定性,耐受高温高压,在多种常用的液体缓冲液中能够保持稳定。对KGM微球用二乙氨乙基盐酸(DEAE-HCl)进行修饰,制备了细胞培养微载体。利用响应曲面法对影响微载体上细胞生长密度的微载体粒径、配基密度、魔芋浓度、交联度的最佳水平范围进行了研究。通过对二次多项回归方程求解得到九组预测参数。根据实际操作条件以及进一步细胞培养验证,得到了最佳工艺条件为魔芋浓度为12%,交联度为25%,粒径大小]60-212μm,配基添加量为0.5 g/g,将这种优化后的KGM微载体命名为A-KGM-1225。静态培养中,Vero细胞在A-KGM-1225上铺展迅速；培养48 h后的激光共聚焦结果显示,Vero细胞在A-KGM-1225上的肌动蛋白表达量比在商品化葡聚糖微载体上表达得更多。微载体的悬浮培养中,A-KGM-1225上Vero细胞的平台期比葡聚糖微载体上细胞的平台期要晚1天。细胞在培养6天以后,A-KGM-1225上的细胞具有更高的糖耗,表现了更强的增殖能力。所有研究结果证实,经优化设计得到的A-KGM-1225,比商品化以葡聚糖为基质的Cytodex-1更有利于细胞的贴附和增殖。为了解决传统方法制备微球粒径分布较宽、产品收率低且重复性差等不足,采用快速膜乳化法制备了粒径小于10μm的且粒径均一的KGM微球。利用正交试验设计考察了不同的油相组成、表面活性剂用量、不同油水比例以及不同交联转速对微球粒径均一性的影响,得出了快速膜乳化法制备微球工艺的最佳方案。在优化的条件下,获得的KGM微球的span值为0.9,平均粒径小于10μm。
【关键词】：魔芋葡甘聚糖 凝胶层析 微载体 膜乳化
【学位授予单位】：中国科学院研究生院(过程工程研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：O636.1
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 1 文献综述14-50
• 1.1 魔芋葡甘聚糖14-20
• 1.1.1 葡甘聚糖的来源14-15
• 1.1.2 魔芋葡甘聚糖的分类15
• 1.1.3 分子结构及理化性质15-17
• 1.1.4 传统及现代应用17-19
• 1.1.5 精粉的制备特性19
• 1.1.6 高纯魔芋葡甘聚糖与普通魔芋葡甘聚糖精粉的比较19-20
• 1.1.7 魔芋葡甘聚糖的高值化研究20
• 1.2 凝胶过滤层析技术20-26
• 1.2.1 层析技术的分类21-23
• 1.2.2 凝胶层析的应用23-25
• 1.2.3 常见的商品化凝胶介质25-26
• 1.3 细胞培养微载体26-40
• 1.3.1 细胞培养发展史26-27
• 1.3.2 动物细胞的培养方法27
• 1.3.3 微载体的发展27-28
• 1.3.4 微载体培养的特点28
• 1.3.5 微载体分类28-31
• 1.3.6 微载体特性对细胞培养的影响31-33
• 1.3.7 微载体的表面修饰33-35
• 1.3.8 细胞与材料的相互作用35-40
• 1.4 微孔膜乳化技术40-47
• 1.4.1 传统乳液制备方法及其缺点40-41
• 1.4.2 微孔膜乳化41-47
• 1.5 论文的立题思路47-50
• 2 魔芋葡甘聚糖的纯化及降解50-64
• 2.1 引言50
• 2.2 实验材料与设备50-51
• 2.2.1 实验材料及药品50
• 2.2.2 实验仪器与设备50-51
• 2.3 实验方法51-54
• 2.3.1 魔芋葡甘聚糖的精纯51
• 2.3.2 DNS试剂的配制51-52
• 2.3.3 魔芋葡甘聚糖含量测定52-53
• 2.3.4 魔芋葡甘聚糖化学基团的检测(FT-IR)53
• 2.3.5 魔芋葡甘聚糖分子水溶液降解行为研究53
• 2.3.6 魔芋葡甘聚糖的化学法降解53-54
• 2.3.7 魔芋葡甘聚糖浆液的粘度测定54
• 2.3.8 魔芋葡甘聚糖分子量测定54
• 2.4 实验结果及讨论54-61
• 2.4.1 魔芋精粉的精制54-56
• 2.4.2 魔芋葡甘聚糖精粉的红外光谱分析56
• 2.4.3 魔芋葡甘聚糖分子水溶液降解行为研究56-58
• 2.4.4 魔芋葡甘聚糖浆液的质量控制58-59
• 2.4.5 降解后魔芋葡甘聚糖浆液的分子量分布59-61
• 2.5 本章小结61-64
• 3 魔芋葡甘聚糖小分子分离介质的制备及应用64-80
• 3.1 引言64-65
• 3.2 材料与设备65
• 3.2.1 实验材料65
• 3.2.2 主要仪器设备65
• 3.3 实验方法65-68
• 3.3.1 魔芋葡甘聚糖微球的制备66
• 3.3.2 微球性能检测66-67
• 3.3.3 微球脱盐试验67
• 3.3.4 魔芋葡甘聚糖微球介质的稳定性研究67-68
• 3.4 结果与讨论68-78
• 3.4.1 魔芋葡甘聚糖微球的含水量68
• 3.4.2 魔芋葡甘聚糖微球外观观察68-70
• 3.4.3 耐压和流速70-72
• 3.4.4 魔芋葡甘聚糖凝胶的分离范围72-74
• 3.4.5 蛋白质脱盐试验74-77
• 3.4.6 凝胶微球的稳定性分析77-78
• 3.5 本章小结78-80
• 4 魔芋葡甘聚糖微载体的制备及应用80-108
• 4.1 引言80-81
• 4.2 材料与设备81-82
• 4.2.1 细胞株及培养基81
• 4.2.2 主要材料与试剂81-82
• 4.2.3 主要设备82
• 4.3 实验方法82-85
• 4.3.1 不同骨架密度的魔芋葡甘聚糖微球的制备82
• 4.3.2 微球的胺化82-83
• 4.3.3 魔芋葡甘聚糖微载体表面形貌观察83
• 4.3.4 魔芋葡甘聚糖微球电荷密度测定83
• 4.3.5 材料表面化学基团的检测(FT-IR)83
• 4.3.6 魔芋葡甘聚糖微载体的预处理83-84
• 4.3.7 细胞静态培养84
• 4.3.8 Vero细胞在微载体表面的核及骨架染色84
• 4.3.9 不同骨架密度的魔芋葡甘聚糖细胞培养微载体对血清蛋白的吸附84
• 4.3.10 Vero细胞动态培养84-85
• 4.3.11 五种细胞系在魔芋葡甘聚糖微载体上生长85
• 4.3.12 统计分析85
• 4.4 结果与讨论85-106
• 4.4.1 不同配基密度的魔芋葡甘聚糖微载体对细胞培养的影响85-87
• 4.4.2 不同粒径大小的魔芋葡甘聚糖微载体对细胞培养的影响87
• 4.4.3 不同骨架密度的魔芋葡甘聚糖微载体对细胞培养的影响87-89
• 4.4.4 响应曲面设计89-94
• 4.4.5 微载体表面形貌94-96
• 4.4.6 魔芋葡甘聚糖微载体对血清蛋白的吸附性96-97
• 4.4.7 魔芋葡甘聚糖微载体表面的化学基团97
• 4.4.8 Vero细胞在材料表面的形态观察及分析97
• 4.4.9 Vero细胞在材料表面的核及骨架染色97-99
• 4.4.10 Vero细胞在载体上的贴附动力学99-100
• 4.4.11 细胞在载体表面生长过程检测100-101
• 4.4.12 五种细胞系在载体的空球率101-102
• 4.4.13 五种细胞在微载体上的生长及新陈代谢102-106
• 4.5 本章小节106-108
• 5 微孔膜乳化法制备魔芋葡甘聚糖微球108-128
• 5.1 前言108
• 5.2 材料和仪器108-110
• 5.2.1 主要材料108-109
• 5.2.2 主要设备109-110
• 5.3 实验方法110-112
• 5.3.1 微孔膜的修饰110-111
• 5.3.2 粘度的测定111
• 5.3.3 油水相界面张力的测定111
• 5.3.4 快速膜乳化法制备魔芋葡甘聚糖微球111
• 5.3.5 魔芋葡甘聚糖微球粒径分布的测定111
• 5.3.6 正交实验111-112
• 5.4 结果与讨论112-126
• 5.4.1 常规膜乳化112-115
• 5.4.2 快速膜乳化115-126
• 5.5 本章小结126-128
• 6 结论与展望128-132
• 6.1 主要研究结论128-129
• 6.2 本论文的创新点129-130
• 6.3 展望130-132
• 参考文献132-142
• 个人简历及发表文章目录142-144
• 致谢144

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  本文关键词：微球型魔芋葡甘聚糖生物材料的结构设计及调控，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：259043