ANP32AB调控HIV-1复制的分子机制研究
发布时间：2025-05-13 00:19
人类免疫缺陷病毒-1型(Human Immunodeficiency Virus,HIV-1)属于逆转录病毒科慢病毒属,其基因组由两条单股正链RNA组成。目前由于该病毒在感染人体内极易发生变异,并具有复杂的免疫逃逸机制,因此仍没有有效的疫苗进行预防。HIV-1在宿主细胞内完成其复制过程大体需要以下几个环节:首先病毒囊膜蛋白与细胞表面的受体和辅佐受体结合、脱壳、逆转录形成双链cDNA进入细胞核、整合到宿主基因组、病毒基因的转录和剪切、病毒mRNA转运至细胞质、翻译病毒的结构蛋白和非结构蛋白、病毒粒子的出芽、成熟及释放等。HIV-1病毒在人体内需要借助大量的宿主因子完成其复制过程。ANP32A和ANP32B均属于ANP32蛋白家族成员,其结构比较保守,N端为亮氨酸富集区,C端为酸性结构域。据报道ANP32A&B蛋白可以通过影响聚合酶的活性参与流感病毒的复制过程,而且可以促进逆转录病毒科中泡沫病毒RNA的核输出过程,但是其具体的机制以及对其它逆转录病毒的影响仍没有明确的报道。为了探索ANP32A&B在HIV-1复制中的作用,本研究首先利用CRISPR/Cas9技术构建了ANP3...
【文章页数】：79 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 引言
1.1 HIV-1概述
1.1.1 艾滋病流行病学
1.1.2 HIV-1病毒的基因组
1.1.3 HIV-1病毒的生活周期
1.1.4 HIV-1病毒感染的临床症状
1.1.5 HIV-1病毒的蛋白功能
1.2 HIV-1与宿主的相互作用
1.2.1 能够抑制HIV-1复制的宿主限制因子
1.2.2 能够支持HIV-1复制的宿主辅助因子
1.3 ANP32蛋白研究概述
1.3.1 ANP32蛋白简介
1.3.2 ANP32蛋白的结构
1.3.3 ANP32蛋白调控细胞内的转运过程
1.3.4 ANP32蛋白家族调节磷酸酶的活性
1.3.5 ANP32蛋白可以调节核染色质的结构
1.3.6 ANP32蛋白在细胞内的分布
1.3.7 ANP32蛋白家族与人类疾病之间的关系
1.3.8 ANP32A&B对病毒复制的影响
1.4 研究目的与意义
第二章 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 细胞与病毒
2.1.2 实验所用仪器
2.1.3 实验所用试剂
2.1.4 实验所用抗体
2.1.5 实验所用质粒
2.2 方法
2.2.1 Western blot检测
2.2.2 ANP32A和ANP32B guide RNA引物的设计和质粒的构建
2.2.2.1 PCR反应
2.2.2.2 转化
2.2.2.3 质粒提取
2.2.3 ANP32A和ANP32B单基因和双基因敲除细胞系的构建
2.2.3.1 质粒转染至细胞
2.2.3.2 细胞RNA提取
2.2.3.3 RNA反转录
2.2.3.4 PCR产物胶回收
2.2.3.5 目的片段与载体的连接
2.2.4 组织细胞DNA提取
2.2.5 RNA的核质分离提取
2.2.6 荧光定量PCR
2.2.7 RNA Scope
2.2.8 激光共聚焦
2.2.9 免疫共沉淀
2.2.10 双分子荧光互补技术(BiFC)
2.2.11 假病毒的包装
2.2.12 嘌呤霉素工作浓度的确定
2.2.13 假病毒的制备
2.2.14 稳定补回表达ANP32A或者ANP32B细胞系的建立
2.2.15 数据处理与分析
第三章 主要研究结果
3.1 ANP32A和ANP32B氨基酸序列和蛋白结构分析
3.2 ANP32A和ANP32B基因敲除细胞系的构建
3.2.1 ANP32A和ANP32B基因敲除细胞系WB鉴定
3.2.2 ANP32A和ANP32B mRNA在各个细胞系中的荧光定量分析
3.3 ANP32A&B双基因缺失显著降低HIV-1病毒组装和Gag蛋白表达
3.4 稳定表达ANP32A和ANP32B细胞系的建立及功能验证
3.5 ANP32A和ANP32B基因缺失对早晚期逆转录产物的影响
3.6 ANP32A和ANP32B基因缺失抑制HIV-1总RNA的产生
3.7 ANP32A&B双基因缺失抑制HIV-1未完全剪切mRNA的核输出过程
3.8 RNAScope证明ANP32A&B双基因缺失后大部分gag mRNA被阻滞在细胞核中
3.9 ANP32A&B特异性的影响RRE依赖的RNA的转运过程
3.10 ANP32A&B能够与Rev蛋白发生相互作用
3.11 ANP32A&B功能的发挥依赖CRM1核输出途径
3.12 CRM1与Rev的相互作用并不依赖于ANP32A&B
第四章 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
本文编号：4045450
【文章页数】：79 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 引言
1.1 HIV-1概述
1.1.1 艾滋病流行病学
1.1.2 HIV-1病毒的基因组
1.1.3 HIV-1病毒的生活周期
1.1.4 HIV-1病毒感染的临床症状
1.1.5 HIV-1病毒的蛋白功能
1.2 HIV-1与宿主的相互作用
1.2.1 能够抑制HIV-1复制的宿主限制因子
1.2.2 能够支持HIV-1复制的宿主辅助因子
1.3 ANP32蛋白研究概述
1.3.1 ANP32蛋白简介
1.3.2 ANP32蛋白的结构
1.3.3 ANP32蛋白调控细胞内的转运过程
1.3.4 ANP32蛋白家族调节磷酸酶的活性
1.3.5 ANP32蛋白可以调节核染色质的结构
1.3.6 ANP32蛋白在细胞内的分布
1.3.7 ANP32蛋白家族与人类疾病之间的关系
1.3.8 ANP32A&B对病毒复制的影响
1.4 研究目的与意义
第二章 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 细胞与病毒
2.1.2 实验所用仪器
2.1.3 实验所用试剂
2.1.4 实验所用抗体
2.1.5 实验所用质粒
2.2 方法
2.2.1 Western blot检测
2.2.2 ANP32A和ANP32B guide RNA引物的设计和质粒的构建
2.2.2.1 PCR反应
2.2.2.2 转化
2.2.2.3 质粒提取
2.2.3 ANP32A和ANP32B单基因和双基因敲除细胞系的构建
2.2.3.1 质粒转染至细胞
2.2.3.2 细胞RNA提取
2.2.3.3 RNA反转录
2.2.3.4 PCR产物胶回收
2.2.3.5 目的片段与载体的连接
2.2.4 组织细胞DNA提取
2.2.5 RNA的核质分离提取
2.2.6 荧光定量PCR
2.2.7 RNA Scope
2.2.8 激光共聚焦
2.2.9 免疫共沉淀
2.2.10 双分子荧光互补技术(BiFC)
2.2.11 假病毒的包装
2.2.12 嘌呤霉素工作浓度的确定
2.2.13 假病毒的制备
2.2.14 稳定补回表达ANP32A或者ANP32B细胞系的建立
2.2.15 数据处理与分析
第三章 主要研究结果
3.1 ANP32A和ANP32B氨基酸序列和蛋白结构分析
3.2 ANP32A和ANP32B基因敲除细胞系的构建
3.2.1 ANP32A和ANP32B基因敲除细胞系WB鉴定
3.2.2 ANP32A和ANP32B mRNA在各个细胞系中的荧光定量分析
3.3 ANP32A&B双基因缺失显著降低HIV-1病毒组装和Gag蛋白表达
3.4 稳定表达ANP32A和ANP32B细胞系的建立及功能验证
3.5 ANP32A和ANP32B基因缺失对早晚期逆转录产物的影响
3.6 ANP32A和ANP32B基因缺失抑制HIV-1总RNA的产生
3.7 ANP32A&B双基因缺失抑制HIV-1未完全剪切mRNA的核输出过程
3.8 RNAScope证明ANP32A&B双基因缺失后大部分gag mRNA被阻滞在细胞核中
3.9 ANP32A&B特异性的影响RRE依赖的RNA的转运过程
3.10 ANP32A&B能够与Rev蛋白发生相互作用
3.11 ANP32A&B功能的发挥依赖CRM1核输出途径
3.12 CRM1与Rev的相互作用并不依赖于ANP32A&B
第四章 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
本文编号：4045450
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/yxlbs/4045450.html
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